Реферати українською » Биология и химия » Моноклональные антитіла


Реферат Моноклональные антитіла

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Харківський національний університет ім. В.М. Каразіна

Харків 2005

При запровадження у організм тварин і людини чужорідних макромолекулярных речовин - білків чи полісахаридів (антигенів) у крові з'являються захисні білки - антитіла, котрим характерна незвичайна, унікальна специфічність. Кожне антитіло дізнається лише свій антиген, точніше, одну його детерминантную групу. Детерминантная група складається з кількох амінокислот (зазвичай з 6-8), їхнім виокремленням просторову структуру, властиву даного білка. У першому білці, що складається з кількох сотень амінокислот, є кілька (5-15) різних детермінант, тож одному білку утворюється ціле сімейство різних за своєї специфічності антитіл. Навіть лише до детерминанте утворюється цілий спектр антитіл, які відрізняються структурі, ступеня специфічності та міцності зв'язування із нею. Те саме стосується і до полисахаридным антигенів, детерминантные групи яких утворюються 3-6 залишками моносахаридов.

Отже, під час введення антигену виникає велике сімейство антитіл, спрямованих до найрізноманітніших його детерминантам і різняться також всередині групи антитіл, спрямованих лише до й тією самою детерминанте. У крові иммунизированных тварин з'являється багатий і унікальний за складу спектр антитіл, що й забезпечує їх абсолютну специфічність в розпізнаванні даного антигену.

Антитела що й широко йдуть на нейтралізації бактеріальних токсинів (дифтерійного, столбнячного), зміїних отрут (кобри, гадюки), вірусів, яких спіткало кров (особливо ефективно вірусу кору), й у ідентифікації індивідуальних білків (та інших антигенів), що у клітині чи найскладніших тканинних екстрактах. Проте інколи потрібні не так багатокомпонентні суміші антитіл, що у крові у відповідь запровадження антигену, а окремі, елементарні складові цю суміш, спрямовані тільки в однієї детерминанте антигену і мають одні й самі характеристики. Такі антитіла бувають потрібні, як вивчення їхнього власного природи, так практичного використання, наприклад для постачання пухлини токсичних речовин.

Отримують їх шляхом імунізації, тобто запровадженням тварині індивідуального антигену або тільки однієї його детерминантной групи, це, зазвичай, неможливо. Чому? Річ у тім, що у організмі процесі дозрівання антителообразующих клітин (АВК) утворюється велика кількість - мільйони генетично однорідних сімейств клітин - клонів, кожен із яких спеціалізується на синтезі лише одну варіанта антитіл, й у причина великого розмаїття антитіл, индуцируемых навіть одним антигеном. Таких клонів значно більше, ніж потрібно антитіл для розпізнавання будь-якого, випадково взятого антигену. Антиген, потрапляючи у організм, стимулює розмноження тих клонів, які продукують антитіла для її детерминантам.

Здається, вихід простий: треба виростити окремі клони антителообразующих клітин на пробірці - у культурі тканин - і вони продукувати моноклональні антитіла, тобто антитіла однієї суворо визначеній специфічності, продукт одного клона. Але це неможливо було: нормальні клітини смертні, невдовзі після висаджування в культуру такі клітини гинуть. Не сягає освіти клонів АВК. Додавання в культуру чинників зростання кілька продовжує їхнє життя, але й не розв'язує проблеми.

Шлях розв'язання проблеми несподівано вказали злоякісні пухлини. Давно вже відомі пухлини в людини - плазмоцитомы, що виробляють і секретирующие до крові імуноглобуліни, структурою своєї неотличимые від антитіл. Причому кожне таке "антитіло" злегка відрізнялася від іншого, вироблюваного інший плазмоцитомой. Образовывалась хіба що колекція випадкових антитіл до невідомим антигенів. Коли накопичилися сотні таких "антитіл" і вони було випробувано з сотнями навмання узятих антигенів, виявилося, що у цій колекції виявилися специфічно реагують пари "антиген-антитіло".

Чому пухлини засвідчили її можливість отримання моноклональних антитіл? Є кілька про причини і усі вони лежать у самій природі пухлинної клітини. Вона або "майже завжди зберігає властивості і функції клітини, з яких стався. Плазмоцитома відбувається з "юних" плазматичних клітин, тобто саме з тих клітин, які синтезують антитіла. Це властивість зберігається у пухлинах, що утворилися з відповідних клітин. Дуже важливу особливість пухлин був частиною їхнього виникнення з однієї генетично зміненої (мутантной) клітини. Тому пухлина і його розвивається клон, у разі як клон иммуноглобулинобразующих клітин. Причому вони утворюють суворо однорідний за всі властивостями моноклональный імуноглобулін.

Нормальні плазматические клітини (чи його попередники - лімфоцити) смертні, їх тривалість життя - за кілька днів. Пухлина, й у її принципова відмінність од нормальних попередників, безсмертна. Її можна культивувати у пробірці чи пересаджувати від однієї тваринного іншому необмежена кількість разів, і протягом необмеженого часу. На відміну від нормальної тканини пухлина автономна, організм "хазяїна" нездатний (за дуже рідкісним винятком) зупинити необмежений зростання злоякісного пухлинного клона.

Плазмоцитомы виникають як спонтанно, тобто непередбачено, хіба що випадково, але можна досить легко індукувати у мишей і пацюків й одержати, в такий спосіб, безсмертний, необмежено зростаючий, перевиваемый клон клітин, які продукують імуноглобуліни, іноді які мають специфічністю антитіл, причому антитіл моноклональних. Цілком природно було бажання імунологів навчитися отримувати плазмоцитомы, продукують антитіла заданої специфічності. І тому мишей спочатку інтенсивно імунізували, та був индуцировали вони плазмоцитомы, щоб отримати пухлини і з тих клонів, які антитіла до антигенів, використаним для імунізації, але ці мало вдавалося. Занадто рідкісні були збіги. Тоді спробували індукувати пухлини антителообразующих клітин опухолеродными вірусами. Результати були кращими, проте створити простий і універсальний метод отримання моноклональних антитіл цьому шляху також немає можливим.

Успіх прийшов, як відомо, несподівано, як побічний продукт дослідження, що мав інші цілі. На початку 1970-х років молодий німецький імунолог Георг Кёлер, який одержав стипендію до роботи на знаменитому Базельському інституті імунології, зацікавився питанням про генетичної мінливості антитіл. Тоді можна було б очікувати, що антитіла мутирують (генетично змінюються) з більшою частотою, ніж інші білки. Для дослідження треба було ізолювати клон АВК, який продукує антитіла певної специфічності, отримати гроші з нього стабільну клітинну лінію, підтримувану у пробірці (у культурі), і простежити, з яким частотою з'являться там генетично змінені варіанти. Задля реалізації проекту Кёлер поїхав до Англію, до лабораторії Цезаря Мільштейна, який вивчав клони плазмоцитом, і вони розробили оригінальний підхід до цієї проблеми: вирішили отримати гібрид нормальної АВК й пухлинної клітини. Що стосується успіху такий гібрид успадкував від нормальної клітини спроможність до синтезу антитіл, як від пухлинної - безсмертя та здатність до необмеженому і безконтрольному зростанню. Це вони змогли здійснити.

Методи гібридизації соматичних (тобто не статевих) клітин на той час були добре відомий і широко застосовувалися до різних цілей. І тому використовували вірус, сприяє злиттю клітин. Разнородные клітини, які мають злилися оболонки, утворювали двуядерные гібриди, які зберігали спроможність до клітинним розподілам. У процесі клітинного розподілу хромосоми обох ядер перемішувались і утворювали загальне ядро. Отже, виникав істинний гібрид, нащадок двох соматичних клітин, чи гибридома. Гибридому можна отримати й між нормальної АВК й пухлинної, плазмоцитомной клітиною. Плазмоцитома було взято вона найбільше відповідала АВК на кшталт диференціювання. Весь її синтетичний апарат був настроєний на синтез імуноглобулінів. Проблема в тому, як відокремити задану гибридому від присутніх у системі окремих неслившихся клітин та від гібридів іншого складу чи іншого специфічності, ніж необхідні.

Досягнення цього автори розробили спеціальну схему, яка використовує відбір клітин на селектирующей середовищі. Передусім було отримано особливий мутант мишачої плазмоцитомы, зростання якого було контролювати складом живильне середовище. Для отримання мутанта використовували особливості синтезу нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), наявних переважають у всіх клітках і необхідні існування. Відомо, що є шляху синтезу попередників нуклеїнових кислот: основний рахунок і резервний. Основний - це новоутворення нуклеотидів, ланок, входять до складу нуклеїнових кислот. Цей шлях включає кілька етапів і блокується противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Проте клітини не гинуть від рівня цього препарату, оскільки мають резервним шляхом - здатністю синтезувати нуклеотиди і нуклеїнові кислоти, реутилизируя продукти розпаду раніше синтезованих нуклеїнових кислот: гипоксантина (Р) і тимидина (Т). Додавання Р і Т в сприятливе середовище, що містить А, знімає токсичний ефект останнього.

Для селекції гібридом треба давалися мутант плазмоцитомы, нездатна користуватися резервним шляхом і, отже, погибающий серед, що містить Р, Т й О (ГАТ-среда). Такий мутант отримали шляхом додавання у середу токсичних аналогів Р і Т. Усі клітини, здатні засвоювати Р і Т, включали їх токсичні аналоги гинули. Виживали лише ті мутанти, хто був нездатні засвоювати Р і Т, тобто позбавлені резервного шляху. З потомства цих клітин додатково відбирали що й такі мутанти, що втратили спроможність до синтезу власних імуноглобулінів. Тепер усі був готовий щоб одержати гібридом, тобто гібридів нормальних АВК й плазмоцитомных клітин.

Мышей інтенсивно імунізували певним матеріалом - білком, бактеріальної клітиною чи клітиною тваринного походження. Коли їх крові з'являлися антитіла, вони брали селезінку і лімфатичні вузли (місця скупчення АВК), і їх готували завись клітин. До неї додавали надміру клітини мутантной плазмоцитомы і полиэтиленгликоль (ПЕГ). Після нетривалої інкубації, потрібну для злиття клітин, їх відмивали від ПЭГа і поміщали у середу, що містить Р, Т й О (ГАТ-среда). Тепер у системі перебували гібриди АВК й АВК, АВК й плазмоцитомы, і навіть решта вільними АВК й клітини плазмоцитомы. У тому числі потрібно було відібрати лише гібриди АВК й плазмоцитомы. Після недовгого (за кілька днів) культивування одиночні АВК, і навіть гібриди АВК й АВК гинули, оскільки нормальні клітини смертні і швидко гинуть у культурі. Плазмоцитомные клітини, і їх гібриди також гинули, оскільки А блокував основний шлях синтезу попередників нуклеїнових кислот, а Р і Т їх рятували. Виживали, отже, лише гібриди АВК й плазматичних клітин, оскільки безсмертя вони успадкували від плазмоцитомы, а резервний шлях - від нормальної клітини. Такі гібриди, гібридоми, зберігали здатність синтезувати і секретировать антитіла.

Наступний етап після отримання гібридом - клонування і відбір потрібних клонів. Выжившие в ГАТ клітини розсівали у спеціальні пластикові планшети, містять зазвичай 96 лунок ємністю приблизно на 0,2 см3. У кожну лунку поміщали у середньому 10 гибридомных клітин, які культивували у присутності "годують" клітин, які мають ставлення до гибридомам, але сприяють їх зростанню. Після днів культивування вміст кожної лунки перевіряли на присутність антитіл потрібної специфічності. І тому використовували микрометоды виявлення антитіл до відповідного антигену. Клітини з ополонок, містять потрібні антитіла, клонували, тобто повторно розсівали із таких ж лункам, але з розрахунку 1 клітина на лунку, знову культивували і перевіряли на присутність потрібних антитіл. Процедуру повторювали 1-2 разу. Отже, відбирали клони, продукують антитіла лише однієї потрібної специфічності, тобто моноклональні антитіла. Отримані клони можна заморозити при - 70њС й берегти доти, поки вони знадобляться. Їх можна культивувати й накопичувати антитіла в культуральної середовищі, а можна прищепити мишам (оскільки гібридоми - це пухлинні клітини), де вони вона зростатиме і накопичувати колосальні кількості моноклональних антитіл. Від однієї мишки можна було одержати антитіл незгірш від, ніж від кролика. Ці антитіла не містять сторонніх антитіл й такі однорідні физико-химически, що може розглядатися як чисті хімічні реактиви.

Застосування: звичайні поликлональные антитіла що й широко застосовуються визначення біологічно активних речовин - білків крові й інших біологічних рідин, гормонів, ростових чинників, клітинних рецепторів, медіаторів запалення і імунітету, бактеріальних і вірусних антигенів, різних отрут тощо. Моноклональные антитіла через найвищої специфічності, стандартності і технологічності отримання успішно витісняють й повністю замінює імунні сироватки.

Далі гібридоми створюють унікальні можливості у аналітичних цілях: їх можна використовувати як "імунологічний мікроскоп" з надзвичайно високим дозволом. Приміром, коли потрібно порівняти дві клітинні лінії, відмінні однією або деякими антигенами, і треба виявити такі антигени, то метод гібридом надає при цьому виняткові можливості. Проиммунизировав мишей одній з ліній і, отримавши сотні гібридом, які продукують антитіла до антигенів лінії, можна знайти одну чи дві з антитілами лише у даної лінії. Размножив таку гибридому у пробірці чи виростивши в мишах, можна отримати роботу дуже багато антитіл до антигену (чи детерминантной групі), загубленому серед інших компонентів клітини аналогічно до голки в копиці сіна. Це буде продукт одного клона. У крові імунізованого тваринного серед багатьох інших антитіл він не проявиться через суто кількісних відносин. Завдяки гибридомам може бути як знайти, а й вивести в лінію й одержати скільки завгодно відповідних антитіл. З допомогою гібридом можна знайти антигени, характерні для пухлин певних тканин, отримати до них антитіла і використовувати їх задля діагностику і типування пухлин. Такі моноклональні антитіла знайшли широке використання у онкологічної клініці. Нарешті, в усьому світі ведуться активні дослідження з використанню моноклональних антитіл як специфічних переносників токсичних речовин, у пухлинні клітини. Поки ж із допомогою моноклональних антитіл в пухлина і його метастази доставляються радіоактивні речовини, дозволяють знайти невеликі вузлики пухлини по локалізації у яких радіоактивності.

Гибридомы відіграли й продовжують грати величезну роль фундаментальної і прикладної імунології. Вони створено з урахуванням клонально-селекционной теорії імунітету і з'явилися найяскравішим і остаточним доказом цієї теорії. Гибридомы зробили реальністю гадані клони антителообразующих клітин та дозволили навіть виявити існування у організмі до запровадження відповідного антигену. Гибридомы революціонізували імунологічну промисловість і дистриб'юторів створили у цілком нові області. Завдяки гибридомам постали нові методи діагностики багатьох захворювань, і

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Схожі реферати:

  • Реферат на тему: Аглаонема
    Аглаонема (Aglaonema) – вечнозелёное трав'янисте рослина з сімейства Ароидные (Araceae), як і
  • Реферат на тему: Адамово дерево
    Кажуть, це єдиний рослина з райського саду, яке прижилося землі. Його приніс, і посадив Адам, щоб
  • Реферат на тему: Хімічні основи виробництва полуничного соку
    З полуниці та інших ягід можна отримати роботу чудові соки, які характеризуються дуже цікавими
  • Реферат на тему: Выгонка квітів до 8 березня
    Для різних рослин технологія выгонки трохи інакша. Примулы краще виганяти в оранжереї, але, у
  • Реферат на тему: Семенное розмноження кактусів
    На погляд може бути, що виростити кактуси з учорашнього насіння – це щось із фантастики, це ж ми

Навігація