>ИЗУЧЕНИЕБИОСИНТЕЗААМИНОКИСЛОТШТАММОМВrevibacteriummethylicum ПРИРОСТЕ НАСРЕДАХ,СОДЕРЖАЩИХТЯЖЕЛУЮ ВОДУ ІДЕЙТЕРО-МЕТАНОЛ.

Про. У.МОСИН

Московська державна академія тонкої хімічної технології їм. М. В. Ломоносова, р. Москва,просп. Вернадського,д.86.

Представлені дані пробиосинтезудейтерий-меченних амінокислотL-фенилаланин-продуцирующим штамом факультативних метилотрофних бактерій B.methylicum.Аминокислоти різного рівняизотопнойзамещенности на дейтерій, яксекретируемие в культуральне рідина у процесі ферментаціїштамма-продуцента, і у складі гідролізатів сумарних білків біомаси, отримано з допомогоюбиоконверсии СП₃>ОН/CD₃>OD на середовищах, містять різні концентрації важкої води, включаючи 24,5 про. % D₂>O до 98 про.% D₂>O. Для вивчення ступенів включення дейтерію в амінокислоти використовували методмасс-спектрометрии електронного удару метилових ефірівN-диметиламино-5-нафталин-сульфонильних (>дансильних) похідних амінокислот. Ступені ізотопного включення дейтерію вфенилаланин,секретируемий в культуральне рідина й у складі гідролізатів сумарного білка змінюються від 27,5 до 95 % залежно від концентрації D₂>O серед. Показано, що з ферментації поруч із основним продуктом біосинтезу (>фенилаланин) в культуральної рідини накопичуються інші амінокислоти , такі якаланин, валин і лейцин (>изолейцин).

ЗАПРОВАДЖЕННЯ

Методмечения стабільними ізотопами є ключовим напрямом у різнопрофільних біохімічних дослідженнях з допомогою амінокислот та інших біологічно активних сполук (>БАС) [1,2]. Тенденції до кращого застосуванню стабільних ізотопів, зокрема, дейтеріюпо-сравнению з радіоактивними аналогами обумовлені такими їх перевагами, як відсутністю радіаційну небезпеку і можливість визначення локалізації мітки в молекулі прямими методами. Інтенсивне розвитокизотопно-чувствительной техніки, передусім спектроскопії ядерного магнітного резонансу (ЯМР), інфрачервоної і лазерної спектроскопії імасс-спектрометрии (МС), останніми роками дозволило значно вдосконалити проведення численних біологічних досліджень denovo, і навіть вивчати структуру і механізм дії клітиннихБАС на молекулярному рівні [3,4].

            Починаючи із перших експериментів Катца з співавт. [5] по культивуваннямикроводорослейChlorella на важкої воді тривають розробки методичних підходів одержанняБАС, зокрема амінокислот, мічених дейтерієм. Потреби вдейтерированних амінокислотах обумовлені їх важливою роллю у різних біохімічних і медичних дослідженнях, і навіть можливістю їх використання їх у синтезах коладейтерированнихБАС, наприклад, в синтезах пептидних гормонів і нейротрансмітерів з допомогоюL-фенилаланина [6-8].

            Нині біотехнологічний потенціал метилотрофних бактерій щоб одержати амінокислот, мічених стабільними ізотопами, зокрема, дейтерієм, загальновизнано [9]. Сучасні методи мутагенезу і селекції відкривають широкі перспективи щоб одержати нових З₁ -утилізують штамів-продуцентів амінокислот, придатних на шляху зростання на D₂>O. У зв'язку з цим, великий практичний інтерес представляє дослідження процесів біосинтезу амінокислот генетично маркованими штамами метилотрофних бактерій, які стійкі до найвищихконцентрациям дейтерію в ростових середовищах.

            Раннє нами була вивчена зокрема можливість використання штами факультативних метилотрофних бактерій B.methylicum щоб одержатидейтерированного фенілаланіну [10]. На відміну від традиційних штамів-продуцентів фенілаланіну, які мають порушено активностіпрефенатдегидратази чидезоксиарабиногептулозофосфатсинтетази, унікальність цього штами у тому, що з біосинтезуL-фенилаланина необхіднийL-лейцин. 

            Метою справжньої роботи була вивчення рівнів включення дейтерію в молекули амінокислот штами B.methylicum яксекретируемих в культуральне рідина, і амінокислот у складі білкових гідролізатів біомаси цих бактерій на середовищах з різним вмістом СП₃>ОН/CD₃>OD і D₂>O у яких.

УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.

                        >Бактериальние штами. Дослідження проводили зL-лейцин-зависимим штамом факультативних метилотрофних бактерій B.methylicum, продуцентомL-фенилаланина. Штам було отримано із колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (>ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики і селекції промислових мікроорганізмів.

            Для приготування поживних середовищ з різним вмістом дейтерію у яких (див. табл.1) використовували безводні солі кваліфікації “>х.ч.”, D₂>O (99,9% D) іСD₃>ОD (97,5 %D), отримані з Російського науково-дос-лідного центру “>Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необхідності важку воду очищали шкідливих домішок, переганяючи її надперманганатом калію. Для отримання похідних амінокислот використовувалиN-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (>дансилхлорид) (Sigma,CША) ідиазометан.Диазометан одержували доходи зN-нитрозометилмочевини (>Мerck, Німеччина).       

            Культивування штами У.methylicum проводили на мінімальних середовищахМ9 [11] як описано у роботі [10]. 

           Экстракцию ліпідів проводили сумішшюхлороформ-метанол (2:1) методомБлайя іДайера [12].

            >Щелочной гідроліз білка. Білок (4-5 мг)гидролизовали в запаяних скляних ампулах в розмірі 5 мл 4 зв.Ba(OH)₂  протягом 24-х год при 110 ⁰З.Гидролизатисуспендировали в $ 20 мл гарячоїдист. води та нейтралізували 2 зв. розчином H₂>SO₄ з наступним відділенням осадуцентрифугированием (10 000 об./хв, 5 хв).Гидролизатиупаривали вроторномиспарителе при 40⁰ З.

            Одержаннядансиламинокислот культуральної рідини. До 200 мглиофилизованних препаратів культуральної рідини в розмірі 5 мл 2 м.NaHCO₃ (2 10^-3 міль) рН 9-10 дробовими порціями при перемішуванні додавали 320 мг (1,2 10^-3 міль)дансилхлорида в розмірі 5 мл ацетону. Реакційну суміш витримували при перемішуванні при 40⁰ З протягом години, потімподкисляли 2 м. розчиномHCL до рН 3,0 іекстрагировалиетилацетатом (3 разу по 5 мл). Об'єднаний екстракт промивали водою до значення рН 7,0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.

           Дансиламинокислоти у складі білкових гідролізатів B.methylicum отримували як описано у роботі [9].

            Одержання метилових ефірівдансиламинокислот. До 20 мл 40 %->ногоКОН у 50 мл ефіру додавали 3 р вологійнитрозометилмочевини і перемішували на водяній бані із льодом протягом 15-20 хв. Після інтенсивногогазовиделения ефірний шар відокремлювали і промивали крижаної водою до рН 7,0, сушили безводнимNaSO₄ і обробляли їм препаратидансилпроизводних амінокислот у складі культуральної рідини і гідролізатів білка біомаси.

            Кількісне визначенняL-фенилаланина в культуральної рідини проводили наспектрофотометре“BeckmanDU-6” (США) при 540 нм після обробки препаратів культуральної рідининингидрином, як у роботі [10].

           Масс-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі “>MB-80A” (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70еВ.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

            Одержаннядейтерий-меченних амінокислот та йогомасс-спектрометрический аналіз.

Дані зростанню штами B.methylicum і максимальному рівню накопичення фенілаланіну в культуральної рідини на середовищах з 2 про.% СП₃ВІН (>СD₃>OD), містять східчастоувеличивающиеся концентрації D₂>O представлені у таблиці 1. Як очевидно з даних таблиці, зростання досліджуваних бактерій на середовищах із дедалі вищими концентраціями важкої води супроводжувався зміною виходів біомаси, часу клітинної генерації і тривалостілаг-фази за збереження здібності синтезувати й накопичуватифенилаланин в культуральної рідини. Тож було необхідно вивчити, як змінюються ступеня включення дейтерію вфенилаланин і амінокислотні залишки сумарних білків біомаси B.methylicum цих умовах.

>ТАБЛИЦА 1.

Вплив ізотопного складу середовища до зростання штами B.methylicum і культурний рівень накопиченняL-фенилаланина в культуральної рідини.

Для визначення рівня включення дейтерію в амінокислоти методоммасс-спектрометрии електронного удару використовували метилові ефіридансил-аминокислот, які хімічно стабільні й дають інтенсивні піки молекулярних іонів в мас спектрах [13]. Як приклад на мал.1 показано фрагментація метилового ефірудансилфенилаланина при електронному ударі. Умасс-спектрах цього похідного, зазвичай, чіткодетектируется пік молекулярного іона метилового ефірудансилфенилаланина М+. зm/z 412. Пікаминного фрагмента А має невисоку інтенсивність, а пікаминоацильного фрагмента У вкрай низьку чи взагалі немає (див. рис. 1).Интенсивности піківаминних Проте йаминоацильних У фрагментів інших похідних амінокислот, наприклад присутніх в культуральної рідиниаланина, валина і лейцину (>изолейцина) при електронному ударі також можна порівняти. Крім вищеозначених піків, вмасс-спектрах електронного удару метилових ефірівдансил-аминокислот фіксуються піки зm/z 250, 234, 170, які відповідаютьдансильному фрагмента і продуктам її розпаду доN-диметиламинонафталина.

>Модификация методу отримання метилових ефірівдансил-аминокислот полягала у прямий обробці препаратів культуральної рідини, отриманої після відділення клітин,дансилхлоридом ідиазометаном. Через війну застосування цієї підходу удалося одержати чіткоинтерпретируемиемасс-спектри електронного удару метилових ефірівдансил-аминокислот у присутності слідових кількостей низькомолекулярних метаболітів середовища проживання і супутніх амінокислот не вдаючись до попередньому хроматографічного поділу і очищенні. Слід зазначити, що за умови проведеннядансильнойдериватизации, для основний амінокислоти лізину характерно освітуди-дансильних похідних, атирозина також відбувається додатковедансилирование погидроксильной ->ОН-группе. Приетерификации амінокислотдиазометаном цілком можливо додатковеN-метилирование поа-NH₂-групі амінокислот, що зумовлює появі вмасс-спектре метилових ефірівдансил-аминокислот піків, відповідних сполук із молекулярної масою на 14 масових одиниць більше вихідних [14]. Як приклад на рис.2,б наведеномасс-спектрсекретируемого фенілаланіну і супутніх амінокислот у складідериватизированной культуральної рідини за умов експерименту 5 (див. табл.1, досвід 5), де концентрація D₂Про серед сягає 49 про.% (спектр наведено щодо контрольних умов (а), де використовували звичайну води і метанол). Зрис.2,б видно, що у умовах величина піка молекулярного іона похідного фенілаланіну (М+. зm/z 414,2) збільшується в порівнянню з контрольними умовами (М+. зm/z 412,0) на 2,2 одиниці, що становить 27,5 % від загальної кількості атомів водню в молекулі. Пік зm/z 400, зафіксований умасс-спектре культуральної рідини (>рис.2,б) найімовірніше відповідає продукту відщіпленняметильной групи -СП₃ віддейтерированного похідного фенілаланіну.

>Масс-спектр культуральної рідини, отриманої на середовищі, що містить 73,5 про.% D₂Про і 2 про. % СП₃ВІН після обробкидансилхлоридом ідиазометаном представлений рис.3,а. Присутність умасс-спектре цього зразка піка молекулярного іона метилового ефірудансил-фенилаланина з М+. зm/z 416,1 (замість 412 у контролі) свідчить про збільшення маси фенілаланіну на 4,1 одиницю, тобто., 51,2 % атомів в молекулі фенілаланіну заміщені на дейтерій (рис.3,а). Слід підкреслити, щовишеобозначенние атоми дейтерію входять у молекулу фенілаланіну з допомогою процесу біосинтезу denovo, т. е. поуглеродному кістяку молекули, оскільки малоймовірно, що вонизаместились в під час виділення амінокислоти з культуральної рідини або за хімічної модифікації фенілаланіну. Що ж до протонів (>дейтеронов) пригетероатомах вNH₂-,NH-, і ->COOH групах амінокислот, всі вони рахуноклегкости дисоціації легко обмінюються на дейтерій навіть за розчиненні амінокислот в D₂>O. Оскільки етапи, пов'язані з обробкою культуральної рідини, що містить дейтерій і її хімічної модифікації проводилися з допомогоюнемеченних компонентів, розчинників й у т.ч. водних розчинів, то ціпротони(дейтерони) черезлегкости дисоціації найважче піддаються точномуподсчету і контролю. Це могло б служити причиною невеликого розбіжності результатів при підрахунку ступенівдейтерированности амінокислот.  

В усіх життєвих досліджуваних зразках культуральної рідини B.methylicum окрім основногосекретируемой амінокислоти (>фенилаланин), виявлено домішки (лише на рівні 3-5мМ)метаболически пов'язаних із неюаланина, валина і лейцину (>изолейцина) (див., наприклад рис3,а). Як очевидно зрис.3,а, ізотопний складаланина характеризувався збільшенням молекулярної маси на 2,5 одиниці,валина-3,5 одиниці, а лейцину (>изолейцина)-4,6 одиницями. Отже, на відміну фенілаланіну, кількість включеного дейтерію на минулих трьох амінокислотах зберігає стабільне сталість у досить широкому інтервалі концентрацій D₂>O серед (від 49 про.% до 98 про.%).  

            Контроль за включенням дейтерію вфенилаланин з допомогою асиміляціїдейтерометанола у разі зростання бактерій на середовищі, що містить звичайну води і 2%СD₃>OD (відповідають досвіду 2, табл.1) показав незначна кількість дейтерію, яке вступає у молекулу фенілаланіну разом із вуглецемСD₃>OD. Відсотокдейтерирования фенілаланіну оцінено за величиною піка 413 з відрахуванням вкладу піка домішки природного ізотопу (трохи більше 4 %,масс-спектр неприведен). Отриманий результат то, можливо обумовленийразбавлениемдейтериевой мітки рахунок перебігу як біохімічних процесів, що з розпадомдейтеро-метанола за його засвоєнні клітиною, і реакціями ізотопного обміну і дисоціації. Наприклад, з чотирьох атомів дейтерію, наявних у молекуліСD₃>OD, лише атом дейтерію пригидроксильной групі -->OD самий рухливий і тому легкодиссоциирует в водної середовищі із заснуваннямСD₃>OH. Три решти атомів дейтерію у складіСD₃>OH входить у цикл ферментативного окислення метанолу, також б міг навести до втрати дейтерію рахунок освіти сполук більш окислених, ніж метанол. Зокрема, отриманого результату за рівнем включення дейтерію вфенилаланин підтверджує класичну схему ферментативного окислення метанолу до формальдегіду у клітинахметилотрофов, який лише після цього асимілюється цього штами метилотрофних бактерійрибулозомонофосфатним шляхом фіксації вуглецю [15].

            Оскільки базовий штам продуцент фенілаланіну бувауксотрофом полейцину, то, очевидно, що рівні включення дейтерію всекретируемийL-фенилаланин і натомість максимальних концентрацій важкої води, може бути нижче теоретично допустимих, внаслідок функціонування клітині низки біохімічних реакцій, що з асиміляцієюпротонированногоL-лейцина ззовні. Зазначена особливість проявляється при біосинтезіL-фенилаланина надейтерированной середовищі, у якій крім метанолу джерелом додаткових протонів єнемеченний лейцин. Так було вфенилаланине, отриманому із середи, що містить 98 про.% D₂Про і 2 про.% СП₃ВІН, лише шість атомів (із 8 обговорюваних) в молекулібиосинтетически заміщені на дейтерій (М+. зm/z 418 замість 412) (>Масс-спектрприведен на рис.3,б). Ці двінезамещенние атома водню могли відбуватися з лейцину і метанолу, проте автори Андрійовича не виключають, що цей ефект є наслідком не асиміляціїпротонированних субстратів, а внеском протонів солей у складі ростовий середовища. Слід сказати, у цьомумасс-спектре фіксується пікобогащенного дейтеріємбензильного фрагмента зm/z 97 (замість 91 у контролі), що те що, що місцями локалізації атомів дейтерію в молекулі фенілаланіну є положенняС1-С6 ароматичних атомів і суміжну із нею становище приуглеродном атомі b. Причому, якминиум чотири може бути локалізовано у