Реферат Ферменти

Ферменти

Можливість проведення різних маніпулювання ДНК in vitro повністю залежить від наявності очищених ферментів, які специфічним чином розрізають, модифікують і з'єднують молекули. Нині відсутні суто хімічні методи, з допомогою яких можна було реалізовувати перебудову молекул ДНК з цими селективностью і розмаїттям, які притаманні ферментативних реакцій. У той самий час з допомогою досить небагатьох ферментів можна одержувати рекомбинантные молекули ДНК. Більшість цих ферментів було відкрито за таких обставин, які пов'язані зі своїми використанням при маніпулюванні з молекулами ДНК. Насправді кожен фермент відіграє каталізатора у цьому чи іншому хімічному процесі, протекающем в організмі, із якої він виділено. Використання ферментів як інструмент при маніпулюванні з ДНК залежить, зокрема, від своїх доступності та стабільності, і особливо від своїх чистоти, і від цього, вільні вони від домішок, які впливають ферментативну активність.

Різні экзонуклеазы розщеплюють ланцюг переважно або з п'ятьма'-, або з 3'-конца, а часом де вони виявляють такий специфічності. Эндонуклеазам вільні кінці зайві, тому дані ферменти можуть гідролізувати кільцеві молекули ДНК. Розрізування здійснюється за внутрішнім фосфодиэфирным зв'язкам, у своїй утворюються фрагменти різною довжини. З допомогою экзонуклеаз також можуть гідно утворюватися короткі полинуклеотидные фрагменти, проте кінцевим продуктом у часто є нуклеозидмонофосфаты, оскільки экзонуклеазы здійснюють гідроліз, отщепляя послідовно один залишок одним.

Нарешті, нуклеазы відрізняються одна одної у тій, з якого боку від межнуклеотидного фосфодиэфирного містка здійснюється гідроліз. Одні ферменти роблять розріз між фосфатом і 3'-гидроксильной групою із заснуванням 5'-фосфомоноэфирных продуктів, інші – між фосфатом і 5'-гидроксильной групою.

Нуклеазы

а. Загальні властивості

Нуклеазы дозволяють специфічним чином модифікувати молекули ДНК і РНК. Кожен фермент можна віднести до того що чи іншому класу відповідно до його специфічністю чи типом реакції, що він каталізує. Так, ряд ферментів, подібно рестриктирующим эндонуклеазам, діють лише на ДНК. Інші, подібно панкреатической РНКазе, гидролизуют лише РНК. Є ферменти, які у ролі субстратів як ДНК, і РНК. Одні нуклеазы переважно діють або на двухцепочечные, або на одноцепочечные полинуклеотидные субстрати, інші не виявляють такий вираженої перевагу.

Нуклеазы можна також ознайомитися розділити на дві такі категорії: экзонуклеазы і эндонуклеазы.

Більшість ферментів згадуються тексті цієї книжки. Нуклеазы, відзначені зірочкою, використовують як рутинні реактиви в експериментах одержання рекомбінантних молекул ДНК і тому розглядаються детальніше.

б. Нуклеазы, специфічні щодо одноцепочечной ДНК

Эндонуклеазы. Деякі эндонуклеазы гидролизуют одноцепочечные молекули ДНК приблизно тисячу разів швидше, ніж двухцепочечные. Така специфічність використовується у багатьох експериментах – при конструюванні рекомбінантних ДНК, при гетеродуплексном аналізі та навіть за аналізі експресії генів. Деякі реакції, катализируемые подібними эндонуклеазами.

Кілька різних эндонуклеаз подібного типу були досить добре очищені і охарактеризовані, щоб їх можна було використовувати як реактивів. Один із них, нуклеаза S1, отримана з висушених препаратів цвілеподібного гриба Aspergillus oryzae; джерелами двох інших широко використовуваних ферментів є Neurospora і Mung beans. Кожен з цих трьох ферментів виявляє максимальну активність і точність розпізнавання одноцепочечных і двухцепочечных молекул за певних умов. Усі три ферменту гидролизуют як ДНК, і РНК. При розриві фосфодиэфирных зв'язку з допомогою цих ферментів утворюються 5'-монофосфатные і З'-гидроксильные кінці.

Экзонуклеазы. Экзонуклеаза E. coli exo VII специфічна щодо одноцепочечных ДНК. Вона має незвичайної экзонуклеазной активністю тому, що ініціює відщеплення і з 5'-, і з З'-концов ланцюга, тоді як найвідоміші экзонуклеазы специфічні до якогось спільного кінцю. Продуктами гідролізу окремих ланцюгів экзонуклеазой ехо VII є олігонуклеотиди довжиною приблизно 25 мономерных одиниць, які містять 5'-фосфомоноэфирные кінцеві групи.

в. Нуклеаза Bal 31

Псевдомонада Alteromonas espejiana секретирует єдину дезоксирибонуклеазу, що отримала назву Bal 31. Що стосується одноцепочечной ДНК, зокрема одноцепочечных ділянок двухцепочечной ДНК, Bal 31 поводиться як эндонуклеаза, діючи аналогічно іншим эндонуклеазам, специфічним до одноцепочечным ДНК. Однак стосовно интактной двухцепочечной ДНК цей фермент виявляє экзонуклеазную активність, очевидно, тому, що він може розпізнавати локальні одноцепочечные ділянки. Bal 31 розрізає обидві ланцюга обох кінцях дуплекса, тобто. здійснює деградацію одночасно у напрямах 3' – >5' і 5'–>3'. Через війну двухцепочечная молекула поступово вкорочується. Якщо емпірично оцінити швидкість цього процесу, те з допомогою ферменту Bal 31 можна одержувати фрагменти ДНК потрібної довжини. Хоча скорочення різних молекул ДНК відбувається несинхронно, виходить набір фрагментів, довжина яких близька до заданої. Через війну вичерпного гідролізу з допомогою Bal 31 проміжні олигонуклеотидные продукти розщеплюються до 5'-мононуклеотидов.

р. РНКазы М

Існує група ферментів, які отримали назву РНКазы М оскільки вони специфічно розщеплюють ланцюг РНК в гибридном дуплексе РНК-ДНК. РНКаза М E. coli є эндонуклеазу, продуктами дії якої є олигорибонуклеотиды з 5'-фосфомоноэфирными кінцями. Цей фермент широко використовують як реактив. Клітини эукариот теж містять таку эндонуклеолитическую РНКазу М. РНКаза Н-экзонуклеолитическая активність властива экзонуклеазе III E. coli і зворотним транскриптазам, кодируемым ретровирусами. Экзонуклеаза III розщеплює РНК до 5'-нуклеозид-монофосфатов у бік З'–>5', а продуктами гідролізу ланцюга РНК з допомогою оборотної транскриптази є 5'-фосфорилированные олигорибонуклеотиды довжиною від двох до десяти нуклеотидів.

Эндонуклеазы рестрикції

Еволюція наділила різні види бактерій унікальними эндонуклеазами, що дають змогу відрізняти власну ДНК від чужорідної. Тим самим було природа постачила учених багатим набором высокоспецифичных реактивів для розщеплення ДНК. Під час вивчення ДНК велике значення мають дві важливі особливості рестриктирующих эндонуклеаз. Перша пов'язані з чудовою здатністю ферменту впізнавати специфічні короткі нуклеотидные послідовності в ДНК. Друга у тому, що є багато різноманітних эндонуклеаз рестрикції, кожна з яких дізнається специфічну послідовність.

а. Три типу эндонуклеаз рестрикції

Эндонуклеазы типів I і І. Ферменти, які стосуються групі эндонуклеаз типів I і II, – це складні білки, які мають активностями рестриктирующей эндонуклеазы і метилазы. Ці цікаві ферменти не використовуються, проте, при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК. Ферменти типу I пов'язуються з ДНК в специфічних ділянках і далі виробляють двухцепочечные розрізи на різному відстані від сайтів впізнавання, варьирующем від 400 п.н. до 7 т.п.н. Для ферментативного гідролізу ДНК необхідні Mg2+, ATP і S

Схожі реферати:

Навігація