Реферати українською » Биология » Полімеразна ланцюгова реакція і електрофорез


Реферат Полімеразна ланцюгова реакція і електрофорез

Страница 1 из 2 | Следующая страница

>Реферат на задану тему:

 

>ПЦР-реакция і електрофорез


2009


 

>ПЦР-реакция

Може виникнути необхідність збільшити кількість індивідуальноїкДНК до її запровадження плазміду з допомогою якогось процесу його відтворення. Такий процес розроблено й широко застосовується як на вирішення цій приватній завдання, а й завжди, коли необхідно помножити кількість певних фрагментів ДНК. Наприклад, фрагментів, містятьизучаемий ген та її регуляторний оточення.

Процес отримав назвуПЦР-реакция, що розшифровується як полімеразна ланцюгова реакція. (У англійському назвіPCR —polymerasechainreaction.) Мимоволі напрошується порівняння з реакцією атомного вибуху. І, мабуть, він втрачає сенс — наростання кількості потрібної ДНК відбувається з надзвичайною швидкістю, навіть бурхливо.

Розглянемо цю реакцію у загальне випадку — напрацювання безлічі копій якогось фрагмента ДНК, що містить у якоїсь частини цікаву для нас послідовність пар підстав. Отже, скажімо, що мені відома послідовність нуклеотидів досить великій відстані певної ДНК тож маємо підстави припускати, що в цієї послідовності лежить цікавий для нас ділянку. Розглянемо серію операцій, які ведуть його виділенню і множенню.

Спершу місцях, лежачих близько, але явно поза даного нас ділянки ДНК, виберемо дві послідовності — по 20 пар нуклеотидів, лежачих з обох боків від рівня цього ділянки. За таких послідовностей синтезуємо хімічно дваоднонитевихпраймера з урахуваннямдезоксирибонуклеотидов. Перший —комплементарно до умовно «першої» нитки ДНК з їїЗаконна, другий —комплементарно до «другий» нитки з їїЗаконна. Вочевидь, що праймери будуть різні.

Тепер додамо в буфер, де розчинене невелика кількість вихідної ДНК обидвапраймера у великому надлишку, нагріємо суміш до температури 94°, і потім швидкоохладим до 50°. ДНКденатурируется при 94°, її нитки розходяться. При 50° обидвапраймерагиб-ридизируются з обраними їм ділянкамиоднонитевих ДНК. Це швидко, оскільки праймери є у надлишку та, крім того, внаслідок своєї дрібниці вони рухливі і легко «знайдуть» свої посадкові місця.Ренатурация ДНК відбувається повільно. За ті 2 хвилини, що тривати цей етап, ДНК малоренатурируется, а праймери встигнуть надійногибридизоваться з комплементарними їм ділянками обох ниток. Така ситуація відбито малюнку 35 (1).Праймери, звісно ж, сідають з3"-конца матричної нитки ДНК і скеровують рух майбутньоїДНК-полимерази до її5'-концу. Цей новий напрям зазначено стрілками. Для зручності описи подальших подій, дамопраймерам назви «лівий» (стрілказачернена) і «правий» (стрілка незачернена).

Тепер швидко піднімемо температуру суміші до 72 °З. нині температурі нитки ДНК явно не зійдуться, а праймери ще утримаються у своїх місцях. Занесемо в розчинДНК-полимеразу. Власне кажучи, вона була від початку!

Але що це за фермент, якийденатурируется при 94°, а при 72° зараз почне вести комплементарний синтез ДНК? На щастя, такаДНК-полимераза існує. Її називають «>TaqДНК-полимераза» і виділяють з дужетермофильних бактерій «>Thermusaquaticus», чудово розмножуються за нормальної температури 85 °З.

Отже, переходимо етапу 2, де зображений процес матричного синтезу комплементарної нитки ДНК, що починається відпраймера і триває без інших (що зазначено стрілою), крім обмеження тривалості цього етапу (3 хвилини). Ми будемо для простоти малюнка розглядати події, які з копіювання лише однієї нитки, хоча, звісно, будуть копіюватися обидві. Вони повністю рівноправні, і на закінчення нашого аналізу треба буде просто подвоїти отриманого результату. Через 3 хвилини закінчується 2-ї етап і температура знову стрибком піднімається до 94°, та ще за мить швидко знижується до 50°. Така ситуація відбито на етапі 3. При 94°новосинтезированная нитку ДНК відокремилася від материнської нитки. (Останню, для ясності, тут і скрізь далі зображую жирною лінією.) У складіновосинтезированной копії більше не зображую «лівий»праймер, оскільки вінкомплементарен материнської нитки ДНК і тому разом із ділянкою, синтезованимДНК-полимеразой, увійшов до складу копії. Натомість цю копію з її3'-конца при 50° на готовий до нього ділянку (адже копія тотожна «другий» материнської нитки) вже сіл «правий»праймер. На вивільнену материнську нитку з їїЗ*-конца теж сілпраймер — «лівий», але, звісно, інший, що пішов із копією, а інший, такий самий. Благо праймери є у надлишку.

На етапі 4 (при 72°) показані дві новікомплементарних синтезу. Той, що відбувається за материною нитки, як і, просторово необмежений. І це той синтез, що починається від правогопраймера, сидячого нановосинтезированной копії закінчиться там, де у цієї копії «заховано» весь колишній «лівий»праймер — з нього ця копія починалася. Через війну тут уперше з'являється обраний для множення ділянку ДНК, обмежений двомапраймерами, включаючи й їхні самих. Це видно на етапі 5, коли відразу після нагріву до 94° все подвійні нитки розійшлися на малюнку виявляються вже 4 одинарних нитки, куди, туди «де їм належить» село 4праймера (два «лівих» і двоє «правих»). Етап 6 — синтез 4-х копій, які починаються від цих коштівпраймеров. У випадках із чотирьох він обмежений довжиною потрібного відрізка ДНК. (Материнська нитку тут, як і скрізь далі копіюється без обмеження справа.) Разом з освіченим на 4-му етапі - й вже обрізаним по обидва боки ділянкою ми маємо 4 фрагмента вихідної ДНК потрібного розміру. Це видно на етапі 7, де всі чотири пари ниток ДНК розійшлися і вже сидять 8праймеров...

Якщо в читача вистачило терпіння розібратися в усій цій «механіці», він погодиться, що розмова після синтезу на етапі 8 вийде вже 11 відрізків ДНК потрібної довжини. Зауважимо принагідно, хоча ми розглядаємо «потомство» самої лише «першої» материнської нитки, серед отриманих відрізків будуть копії ділянок як «першої», і «другий» материнської нитки, оскільки ми готуємося вже кілька разів вели комплементарний матричний синтез.

Простежимо тепер закономірність, відбиту в цифрах, що стоять праворуч від малюнка, близько зображень 3-го, 5-го, 7-го і 8-го етапів. Перед дужкою щоразу стоїть число одиночних ниток ДНК після нагрівання до 94°. Легко помітити, що його незмінно подвоюється. Як слід було очікувати, оскільки у кожному з попередніх парних етапів усі наявні у наявності нитки ДНК однак копіюються.

Але що може бути несподіваним, і що полягає вся сутьПЦР-реакции. Кількість фрагментів потрібного розміру, вказаний у дужках, наростає незрівнянно швидше: 0-1-4—11 штук. Так і далі. Кожен укорочений відрізок буде копіюватися у тому розмірі. І кількість їх безупинно поповнюватися з допомогою не відразу укорочених відрізків ДНК. Через 30 циклів, подібних розглянутим (а кожен цикл — це два етапу) кількість ниток ДНК досягне величезної цифри. До того ж всі вони вже буде потрібної довжини — і виділення фрагмента, та її множення відбулося! Пригадаємо, що маємо від початку було дві нитки. Отже написане число треба подвоїти.

Що це над штуки, а вагових одиницях? Можна підрахувати, що й було спочатку всього 10 молекул ДНК, у 1000 пар підстав кожна, то результаті 30-ти циклівПЦР-реакции має вийти близько2-х мікрограмів необхідного генетичного матеріалу. Для сучасних методів без дослідження те дуже значний кількість.

Насправді в підрахунках кінцевий вихід ДНК вийде значно завищеним, оскількиTaqДНК-полимера-за зношується, а після 30 циклів взагалі перестає «працювати». Але ж можна внести нову порцію ферменту і запустити ще 30 циклів. (Попутно відзначу, щоTaqДНК-полимераза невідь що «сувора». Після 30 циклів у середньому 1нуклеотид з 400 виявляється включеним помилково.)

Зрозуміло, всі ці цикли здійснюються не вручну, а спеціальному приладі, від якої, втім, потрібно багато. Тільки нас дуже швидко по означеній вище програмі змінювати температуру дуже малий об'єм рідини (захищеної від випаровування тонким шаром мінерального олії). Що ж до тривалості 30-ти циклів, то навіть, з урахуванням, що тривалість синтезу доводиться у зазначеній вище причини поступово збільшувати від 3-х до десятьох хвилин, то, на один цикл прилад витрачатиме загалом 12 хвилин. На 30 циклів — 6 годин.

Від експериментатора потрібно лише правильно скласти робочу суміш. Зрозуміло, якщо праймери вже обрані і синтезовано достатньої кількості.TaqДНК-полимераза інуклеозидтрифосфати є у продажу.Наработку великої кількості певного гена з допомогоюПЦР-реакции часто називають «клонованому» цього гена.Описанную тутПЦР-реакцию з цими двомапраймерами інколи іменують «симетричній», на відміну інший тежПЦР-реакции, але з однією початковимпраймером, яку називають «асиметричною».

>ПЦР-реакцию треба включити в описану там послідовність операцій між отриманнямкДНК і включенням ДНК в плазміду. І тут послідовність 21-гонуклео-тида дляпраймеров доведеться вибирати не вільно, а точно по кінців гена, що кодує наш білок. Ці обидва кінці можна встановити, як це було описано з допомогоюЧИП-метода. І тому навіть треба знати всюаминокислотную послідовність білка, лише кінцеві ділянки — по 7 амінокислот з кожного кінця. (Благо, як уже згадувалося, секвенування білка тепер можна розпочинати з будь-якого кінця.) При синтезіконцевогопраймера треба лише додати кінцевийкодон УГА, який транскрибується виРНК. З іншого боку до «зовнішнім» кінців обохпраймеров можна буде нинішньому етапі додати невеликі послідовності нуклеотидів, які, який бувкомплементарни ні з якому ділянці гена, ні ігибридизоваться. Але спроможні створити два «липких» кінця на подальше включення розмноженоїкДНК в розрізані плазмідами. На рис. 35 додаткові послідовності зображені як «хвостиків» упраймеров. Нагадаю, що ця розмноженакДНК нам знадобилася у тому, аби домогтися досить ефективного включення містять її плазмід в бактерію, яка, розмножуючись, буде напрацьовувати було багато потрібний нам білок.

Весь повний комплекс заходів для множенню кількості індивідуального білка іноді виявляється настільки ефективним, що чужорідний білок в цитоплазмібактерий-рециплиентов з'являється у ході їхньої розмноження як гранул. Адже він чужій — і тому не витрачається у самій бактерії. Після лізису клітин гранули взяток простимцентрифугированием. Для їх дисоціації доводиться використовувати обробку осаду лугом,детергентами імочевиной. Білокденатурируется. На йогоренатурации доводиться вдаватися до розведення,диализу відденатурирующих добавок, зміни рН і іонній сили середовища.

Справжність напрацьованого білка перевіряють за ферментативної активності, якщо він мусить такою мати. Вони ж поелектрофорезу — порівнянням із контрольним препаратом. Але надійніше — однією з імунологічних методів контролю, з якими ми познайомимося свого часу.


2.Электрофорез

Метод електрофорезу таїть у собі масу «підводних каменів», чому сліпе копіювання описаних у Пророчих наукову літературу прикладів її використання наводить, зазвичай, до плачевних результатів. Тому спробуємо дати раду фізичних засадах методу глибше..

 

2.1 Введення ЄІАС у метод електрофорезу

Уявімо два ємних судини, з'єднаних між собою тонкої і довгою скляній трубочкою, на кшталт літери М. Нехай судини і трубочка заповнені слабким розчином кухонної солі. У судини опустимо електроди — зволікання, з'єднані зклеммами джерела постійної напруги. Приміром, нехай зволікання із правої судини прилучена до клемі «-», та якщо з лівого — до клемі «+». Це потім будуть, відповідно, наші катод і анод. Ввімкнемо напруга.Миллиамперметр джерела покаже, що у замкнутої ланцюга протікає якийсь струм. Він тече через сольовий розчин, зокрема і вздовж трубочки. Саме вона б нас і цікавить. Вдумаймося у те, що відбуватиметься. Якихось інших розчинених речовин, у трубочці немає. Електричний струм обумовлене винятково рухом двох іонів — негативними іонамиСl і позитивнимиNa+. Перші рухаються вліво, до аноду, другі — вправо, докатоду.

Чи варто побоюватися, що запас іонів С1- іNa+ в трубочці згодом вичерпається? Ні. Бо з резервуара катода в трубочку входитимуть іониСl-, та якщо з резервуара анода — іониNa+, підтримуючи незмінною концентрацію обох іонів у ній. Принаймні так триватиме до того часу, доки вичерпаються чи навіть суттєво зміняться запаси цих іонів лише у резервуарах. Ми цього доводити думати.

Поставмо тепер наївним питанням: що змушує який-небудь конкретний іон (нехай С1-), що у трубочці, рухатися вліво у напрямку до аноду? Відповідь очевидний _ електричне полі. А конкретніше?

Якщо по трубочці тече електричний струм, то вона ж виконує функцію провідника і, отже, її у подається певне «напруга». А звідки, запитаємо себе, якийсь індивідуальний іон С1-, що у середині трубки «знає», що до її кінців докладено напруга? Але якщо до кінців будь-якого провідника докладено напруга, то цьому провіднику на його довжині негайно утворюється електричне полі. Вона буде є тим інтенсивнішим (сильніше), що більше напруга й коротше трубочка. Значимість інтенсивності електричного поля була в будь-якій точці однорідної провідника визначають як Є =V/1, де V _ напруга, яке подається на провідник, а 1 — його довжина. Цю величину називають «напруженістю» електричного поля була в даної точці провідника. Одиницею напруженості, очевидно, єВ/см.

Значимість напруженості поля і «відчуває» будь-який іон, що у цієї точці, вона змушує її рухатися до відповідногоелектроду. У однорідному провіднику напруженість поля однакова у будь-якій точці. Підкреслимо, що напруженість поля залежною (практично) від що у трубочці у "малих кількостях речовин, хоча теж іонів. Її визначають основні носії струму, тому випадку іони С1- іNa+. Проте самі ці «сторонні» речовини, якщо вони також іони, будуть у повною мірою відчувати вплив електричного поля.

Сила, діюча про всяк іон дорівнює твору величини його заряду на напруженість поля. У нашій трубочці вона постійна і ми могли очікувати з урахуванням законів механіки, що це іони рухаютьсяравноускоренно. Цього немає від спротиву, що надає такому руху довкілля, у разі вода. У результаті заряджений іон буде «пробиватися», мігрувати до свого аноду досить повільно й із постійною швидкістю, оскільки сила тертя збільшується зі збільшенням швидкості міграції до того часу, поки не зрівняється з силою, що веде іон для їїелектроду. У різних іонів ця швидкість може бути різною, оскільки сила тертя залежить ще

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація