Реферат Нокаут генів

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Зміст

Тези

Вступ

1. Метод генетичного нокауту

1.1 Особливості векторних конструкцій

1.2 Внесення вектора в ембріональні власні стовбурні клітини

2. Роль метилування ДНК у контролі геному

3. ">Программируемий нокаут генів"

4. Лініїнокаутних мишей

4.1ФНО/ЛТ панель

4.2BALB/cMBD2

4.3B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.4C57BL/MUC2

4.5C57BL/6Kaiso

5. Приклади використаннянокаутированних мишей вивчення функцій генів і спадкових захворювань людини

Висновки

Список літератури


Тези

>Нокаут гена (>geneknockout) — це метод молекулярної генетики, у якому з організму видаляють чи роблять непрацездатними задані гени. Отже отримують організм,нокаутний по непрацюючим генам.Нокаутние організми допомагають дізнатися функції генів,нуклеотидная послідовність яких відома. Відмінності міжнокаутним і нормальним організмом свідчить про функції вимкненого гена.

Цю методику залежить від цілеспрямоване внесенні зміненого,мутированного гена в спадкову інформацію клітин. Новий ген вносять у отримані з ембріонів власні стовбурні клітини, а результат оцінюється в дорослому тварину, тому поки що не розмови про застосуванні даної технології люди: багато робіт зі стовбуровими клітинами людини майже всюди заборонені, та й вирощування мутантних особин Homo sapiens в експериментальних цілях представляється малореальним.

Стандартної біологічної моделлю, на яку розроблено методику, є лабораторні миші.

Лауреатами Нобелівської премії 2007 року у медицині і фізіології стали МаріоКапекки, ОліверСмитис і сер Мартін Еванс – розробники технологіїgenetargeting – способу змінити окремі гени у ссавців. Йдеться передній кордоні сучасної науки про живому, справжньої генетичної інженерії, яку мріяв ще Уеллс "Острові доктора Моро".


Вступ

З перших днів виникнення генетики як науки, вчені мріяли отримувати спрямовані мутації, які заторкують гени досліджуваних ними ознак. Першим кроком для реалізації цієї мрії було відкриття радіаційного та хімічного мутагенезу. Закінчення секвенування геному людини у 2001 р. [28,12] вивело новий рівень дослідження з виявлення нових генів і функціонально значимих послідовностей геному. Нині біотехнологія і біоінформатика в комбінації з класичною біохімією і генетикою є потужними інструментами для аналізу наявної послідовності геному чоловіки й модельних організмів. Але справжнє прорив у спрямованих мутацій було здійснено завдяки використанню феноменагомологичной рекомбінації між порівняно невеликим ділянкою екзогенної і серпоподібною клітинною ДНК. Він отримав назву спрямованої інактивації гена чи нокаут гена (від анг.knockout, синонім –genetargeting). Знаючи послідовність досліджуваного гена людини, з'явилася можливість у вигляді інактиваціїгомологичного гена у модельний організм визначити біохімічну і фізіологічну роль його продукції. Оскільки дуже багато хвороб людини у основі має спадковий компонент, моделі захворювань, створені із цієї стратегії, дозволяють розширити наше розуміння біохімії і фізіології спадкових патологій і приведуть до створення нових підходів на лікування.

Лауреатами Нобелівської премії 2007 року у медицині і фізіології стали МаріоКапекки, ОліверСмитис і сер Мартін Еванс – розробники технологіїgenetargeting – способу змінити окремі гени у ссавців. Йдеться передній кордоні сучасної науки про живому, справжньої генетичної інженерії, яку мріяв ще Уеллс "Острові доктора Моро".


1. Метод генетичного нокауту

>Нокаут гена – це молекулярно-генетичний метод, під час якого задумані дослідником зміни вносять у нуклеотидну послідовність досліджуваного гена або його регуляторних елементів. Миша є найбільш адекватним модельним тваринам від використання технології інактивації генів. Це пов'язано з такими причинами:

а) миша – добре вивчений і доступний об'єкт;

б) геном миші й узагалі людини містить приблизно однакове число генів;

в) подібність амінокислотних послідовностей всіх білків чоловіки й миші становить близько 90 відсотків%.

Проте основною причиною використання миші як модель для інактивації гена є можливість ізолювання ембріональних стовбурних клітин, у яких будь-який ген то, можливо модифікований [29]. Клітинні лінії, містять модифікований ген, може бути привнесені в що розвивається зародок, що дозволяє їм отриматихимерное тварина, несучий штучно створену мутацію (рис. 1).

>Рис. 1. Стратегія отримання лініїнокаутированних мишей [5].


Молекулярно-генетичним механізмом, що дозволяє здійснювати інактивацію гена, єгомологичная рекомбінація між екзогенної ДНК, несучою задумані дослідником зміни, і геномної ДНК об'єкта.

Класична схему одержаннянокаутированних мишей включає кілька етапів: отримання векторної конструкції, з наступним внесенням їх у культуру ембріональних стовбурних клітин (ЕСК) і відбіртрансформантов. Трансформовані ЕСК вносять в зародок, і збереження одержаних химерних тварин схрещують щоб одержати лінії мишей,гомозиготних по отриманої мутації (див. рис. 1).

1.1 Особливості векторних конструкцій

Залежно від поставленого завдання використовуються два типу векторів: замісник івставочний. Перший тип векторів дозволяє замінити ділянку гена мішені, тоді як другий інтегрує в досліджувану послідовність. Будова обох типів векторів однаково, крім орієнтації що фланкують послідовностей (рис. 2). Найчастіше використовуються які заміщають вектора.

>Рис. 2. Два типу векторів – замісник (А) івставочний (Б) – та його механізми інтеграції в геном [5].


Вектор для трансформації несе клоновану послідовність досліджуваного гена, з внесеними у ній необхідними змінами. Це то, можливо: внесеннястоп-кодона, що веде до синтезу короткого неактивного пептида;делеция однієї чи кількохекзонов;делецияпромоторной області; вставка, яка веде спричиняє порушення нормально функціонувати гена й інші зміни, що призводять на відсутність функціонального продукту досліджуваного гена чи значно які знижуватимуть його активність. У цю послідовність вноситься позитивний селективний маркер (МШС), яким є генneo. Продукт цього гена дає несучим його клітинам стійкість до антибіотиківнеомицину іканамицину.Модифицированная послідовність мусить бутифланкирована незміненими ділянками, відбуватиметься проходити рекомбінація. Ефективність рекомбінації залежить від довжини що фланкують послідовностей [22], що у своє чергу залежить від можливостей вектора (рис. 3). При довжинігомологичного плеча майже п'ять тис.п.н. відсоток рекомбінації становить 0,001.

>Рис. 3. Залежність частоти інтеграції вектора від довжинигомологичних плечей [22].


Як вектора можна використовувати бактеріальні штучні хромосоми (>BAC), зі вставками фрагментів геному миші. І тут розмір одного плеча їх може становити до 150 тис.п.н., а розмірделеции до 25 тис.п.н. Найкращий відсоток рекомбінації (8,3%) отримано авторами з допомогою довжини плеча 110 тис.п.н. [26].

Існує ймовірність, що рекомбінація пройде за досліджуваним нами ділянкам геному, а будь-який інший схожою області. У цьому генneo (МШС) збережеться, й уотобранном пулі ЕСК будуть присутнірекомбинантние клітини, не які мають необхідних змін. Проблема вирішується внесенням в векторну конструкцію маркера негативною селекції (>МОС). Їм може бути гентимидин-кинази простого вірусу герпесу (>HSV-tk) чи ген дифтерійного токсину А (>DT-A), продукти яких вбиваютьеукариотические клітини. СтановищеМОС із зовнішнього бокугомологичного плеча вектора дозволяє елімінувати після проходженнягомологичной рекомбінації (рис. 4). У разінегомологичной рекомбінації,МОС виявляється інтегрованим у геном трансформованої клітини, що зумовлює її елімінації. Наявність двох маркерів селекції (позитивного і негативного) дозволяє швидко і ефективно проводити відбір потрібнихтрансформантов [23,19].


>Рис. 4. Дія системи позитивної – негативної селекції: А) інтеграція вектора у потрібний ділянку геному, яка веде до нокауту гена, Б) випадкова інтеграція (синтезтимидин-кинази і смерть клітин) [19].

1.2 Внесення вектора в ембріональні власні стовбурні клітини

Для трансформації використовують ембріональні власні стовбурні клітини мишей. Поза тим, що культура ЕС клітин здатна зростати in vitro, під час пересадки у дорослу мишу чи ембріон клітини часто мають здатність приживатися. ЕС клітини, на відміну спеціалізованих соматичних клітин, зберігають генетичні потенції без тканинної спеціалізації. Ці клітини мають "мінімальний" фенотип: мінімум рецепторів і програм для взаємодії змикроокружением, оскільки лише 5% з 500 генівтранссигнализацииекспрессировано впролиферирующих ЕСК. Другий найважливішої характеристикою ЕСК у культурі є практично необмежений потенціал проліферації, обумовлений особливостями фенотипу незрілих клітин. Третьої особливістю ЕСК є зростаннясуспензионними клонами було без будь-якої домішки просунутих клітин, прикріплених до підкладці. Кожен клон у такому культурі є похідним однієїпрародительской ЕСК [1].

Ембріональні власні стовбурні клітини миші вперше одержані 1981 року [8], що дозволило у розвиток робіт з інактивації генів. Внесеннялинеализированного вектора в ЕС клітини можливо кількома методами:микроинъекция, трансфекція (>електропорация),трансдукция (вірусна інфекція). Перелічені методи мають переваги та недоліки.

>Микроинъекция дозволяє собі з частотою до 100 відсотків вноситиекзогенную ДНК у клітину, а частотагомологичной рекомбінації становить близько 0,67%. Цей метод, безсумнівно, є найефективнішим. Проте задля здійснення мікроін'єкції потрібно дороге обладнання та високій кваліфікації експериментатора. До того ж, сам метод дуже трудомісткий і чимало часу.Векторние конструкціїмикроинъекцией можна вносити й узиготу, але відібрати потрібнітрансформанти у разі неможливо.

Найбільш вже економічними і ефективними методами внесення екзогенної ДНК у клітину єелектропорация і ретровірусна інфекція. До їх гідностям, насамперед, слід віднести можливість одноразово обробити сотні тисяч клітин, які завдяки системіпозитивной-негативной селекції досить швидко проходять відбір. Це значно спрощує і робить економічно вигідним, протимикроинъекцией, процедуру отримання трансформованих клітин. Обидва методу мають недоліки: більшому відсоткунегомологичной рекомбінації із внесенням векторних системелектропорацией проти іншими методами,ограничение розміри ретровірусних векторів тощо. [21]. Найчастіше внесення векторів у клітину проводять із допомогоюелектропорации. У той самий час ретровірусна інфекція дозволяє вноситиекзогенную ДНК у ЕС клітини, а й у ембріони. Отже, лінія трансформованих клітин одержана і підтримується. Наступний етап – внесення клітин на ембріон миші (зазвичай, на стадіїбластули).Химерний зародок підсаджуватимуть в матку брехливо вагітної самки. Отриману в такий спосіб химеру схрещують з, але у яких відмінності (наприклад, колір) тваринам. Якщо отримані у першому поколінні миші мають фенотип лінії, з якої отримані ЕС клітини, їх можна використовуватименасищающего схрещування. Результатом буде отримання лінії тварин,гомозиготних по створеної мутації.


2. Роль метилування ДНК у контролі геному

Однією з способів видозміни гена є його заміна на безглузду послідовність ДНК — тоді ген "вимикається". Дослідники систематично "виключають" гени і спостерігають, до яких наслідків лише на рівні організму наводить це "вимикання". Така методика називається "генетичний нокаут" (>geneknockout).

Вона дозволяє докладно вивчити функцію конкретного гена під час ембріонального розвитку та після народження тваринного. Можна простежити, як і кожен ген впливає розвиток організму, що виникнення тій чи іншій патології. У зв'язку з цим, метод ще отримав назву "генетичне планування". На сьогодні вже зроблено досліди по "вимиканню" тисяч генів миші, це половина всього мишачого геному.

Для розвитку організму буде достатньо однієї клітини з одиничної (ясна річ,диплоидной) копією ДНК, яка за розподілі точно відтворюється від клітини до клітини. Це стосується практично всім живим багатоклітинним істотам. Людина усі його клітини містять ідентичну ДНК. Клітини крові, печінки, мозку, власні стовбурні клітини - всі вони однакові по ДНК. А чим визначається розмаїття наявних проблем людинивисокоспециализированних клітин та тканин? Це досягається через включення чи вимикання генів, відповідальних за спеціалізацію клітини. Саме механізми контролю роботи, чи як, експресії генів є темою досліджень нашої депутатської групи. Однією з таких механізмів єметилирование генів -ковалентное приєднанняметильной групи в розмірі 5 становищіпиримидинового кільцяцитозина. ДНК, що міститьметилированниецитозини, єтранскрипционно неактивною, і гени, які містяться поблизуметилированних районів, мовчать.

Роль метилування ДНК і механізм його негативної дії працювати генів у процесі життєдіяльності хребетних організмів (на моделях жаби, миші і клітинних ліній людини).

>Метилирование ДНК у хребетних набуває значеннєву навантаження як придушення транскрипції сусідніх генів двома основними способами: (А) з допомогою прямого на ДНК, у якоїметилированнийцитозинингибирует зв'язуваннятранскрипционного чинника зі своїми ділянкою, і (Б) з допомогою специфічного зв'язування зметилированним районом спеціалізованихметил-ДНК котрі дізнаються білків, які, своєю чергою, приваблюють складні механізми придушення транскрипції шляхом модифікації сусідніхгистонов.

Свідченням охарактеризований білокКаизо.Каизо, з одного боку, пов'язують ізкатениномр120, з другого - здатний придушуватитранскрипционную активністьметилированних генів.Каизо має доменну структуру і складається зN-концевогоBTB/POZ домену іC-концевих цинкових пальців типуC2H2. Цинкові пальці специфічно пов'язують5-метилцитозин що містить ДНК.

>Нокаут генаКаизо призводить до часткової резистентності тварин до раку кишечника. Крива виживання тварин із нокаутом генаКаизо (червона лінія) в моделі спонтанного раку кишечникаAPC(Min). Чорної лінією показано крива виживання контрольних тварин

Проведено генетичний нокаут генаКаизо у мишей. Показано, що безКаизо (>Каизо-КО) розвиваються нормально не мають виражених патологій . При переведенняКаизо-КО тварин на генетичний фон з великим відсотком спонтанних пухлин кишечника відбувається збільшення терміна життя тварин, зменшується середня площа поліпів в кишечнику. Отже, встановлено, щоКаизо відбувається уповільнення зростання пухлин кишечника вAPC(Min) моделях Навпаки, при вимиканні генаКаизо взиготах жаби відбуваєтьсяапоптотическая смерть клітин ембріонів на стадіїнейрули. На відміну від миші, генКаизо є необхідною для життєдіяльності земноводних. Ці дані підтверджено і рибахDanioRerio . Отримано лінії клітин із множинними генетичними нокаутами генівMBD2,MeCP2 іКаизо. Показано, що білкиMBD2,MeCP2 іКаизо надаютьсинергетическое дію (>репрессируют)метилированний промотор генаXist . Показано, що мутації в геніКаизо є ключовими в ініціюванні синдромуРетта (>нейродегенративное захворювання в дівчаток) , хоча інший мітив ДНК зв'язуючий білокMeCP2 безпосередньо втягнутий у цю патологію.

У геномі хребетних знайдені та охарактеризовані два гена, які кодують білкиZBTB4 іZBTB38, які через свої амінокислотною послідовності і розташування консервативних доменів родичіКаизо. Показано, що ці дві білка є мітив ДНК залежнимитранскрипционнимирепрессорами.


>Каизо такий білокZBTB4 лежить уметилированних ділянкахгетерохроматина. Клітини без метилування - мишачі ембріональніфибробласти з генетичноїделецией генівdnmt1-/- іp53-/-. Клітини з рівнем метилування - мишачі ембріональніфибробластиp53-/-. Що стосуєтьсяdnmt1-/-p53-/- клітин видно відсутність кореляції між локалізацієюZBTB4 вгетерохроматине (>DAPI), тоді, як іp53-/- клітинах видно повнако-локализацияZBTB4 ігетерохроматина.


3. ">Программируемий нокаут генів"

Слід зазначити, що не гени можнаинактивировать на стадії зародка. І, природно, не можна отримати клітини або тварин,нокаутированних по так званим генам домашнього господарства. Проте задля генів, що у ембріональному розвитку, розроблений підхід, дозволяє проводити їхню інактивацію після розвитку організму. Ця стратегія дозволяє "вимикати" гени за певних умов ("ніжний нокаут генів", анг.conditionalknockout), приміром у необхідної досліднику рядна або групі клітин і/або під впливом що індукує речовини.

Це можна здійснити з допомогою методики, яка поєднувалагомологичную рекомбінацію, як у класичного нокауту генів, і системисайт-специфической рекомбінації.Сайт-специфическиерекомбинази – це ферменти,узнающие

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація