Реферати українською » Ботаника и сельское хоз-во » Визначення рівня природної резистентності та оцінці імунного статусу риб


Реферат Визначення рівня природної резистентності та оцінці імунного статусу риб

Страница 1 из 4 | Следующая страница

             МІНІСТЕРСТВОУТВЕРЖДАЮ
    СЕЛЬСКОГО ГОСПОДАРСТВА
     І ПРОДОВОЛЬСТВА Заступник керівника
    РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ Департаменту ветеринарії
      (>Минсельхозпрод Росії)  
 

  ДЕПАРТАМЕНТВЕТЕРИНАРИИ В.В.Селиверстов
 

107139, Москва, Орликів перекл., 1/11
    Для телеграм: Москва, 84
  МинсельхозпродТелекс:41773К ЛЕН
   Телефони: 975-58-50; 975-54-23
   № 13-4-2-/1795 від 25.11.99
 

>МЕТОДИЧЕСКИЕУКАЗАНИЯ
  ио визначенню рівня природною
   резистентності й оцінки імунного
            статусу риб

1.    Загальні засади

Природнарсзистентность риб - це вроджена здатність організму
протистояти агресивному впливу патогенних чинників біотичної і
>абиотической природи, зокрема, збудників інспекційних і інвазійних
хвороб Паркінсона й продуктів їх життєдіяльності (>екзо- іендотоксинам).Иммунний
статус - це структурно-функціональне стан імунної системи в
конкретний момент життя особини. Імунна система риб є
сукупність клітинних і гуморальних чинників імунітету і складається з клітин
>лимфоидно-макрофагального комплексу (лімфоцитів,гранулоцитов, клітин
>Купфера, Лангерганса тощо.) і гуморальних компонентів (імуноглобуліни,
система компонентів комплементу,лизоцим,С-рсактивнис білки, інтерферон,
>лизини,гемолизини,гемагглютинини тощо.). Клітинні елементи імунної
системи зорганізовані у тканинні і органні структури. До них належать: тимус,
селезінка, печінку,лимфоидная тканину головного ітуловищного відділів нирок,
скупчення лімфоїдної тканини черепній коробки, кишечника,перикарда,
>Лейдигова іепигональних органів.Лейдигов іепигональние органи зустрічаються
тільки в хрящових, а скупченнялимфоидно-миелоидной тканини в черепній
коробці у хрящових і кістковихганоидов. Значна частка власності
>иммунокомпстентних клітин є складовою крові й лімфи.
Імунна система риб відрізняється від такою вищих хребетних відсутністю
лімфатичних вузлів, кісткового мозку іфабрициевой сумки (як це має місце біля
птахів); імуноглобуліни у риб представлені, лишеigm подібними антитілами,
тоді як в теплокровних - 5 класами (>igg,igm,iga,igd,ige).

Для оцінки природною резистентності організмів риб до заразним
хворобам, використовують різноманітні методичні прийоми аналізу структурно-
функціонального стану імунної системи. Вони на реєстрації
показників специфічних інеспецифичсских чинників клітинного і
гуморального імунітету.

2. >Неспецифические чинникииммунитетаНеспецифические чинники імунітету беруть участь у реалізації функцій захисту організму риб від чужорідних тіл, незалежно від специфічних чинників, є природними чи уродженими компонентами організму риб і виникають знову під час зустрічі чужорідними тілами. Залежно від структурної організації виробництва їхньої компонентів поділяються на клітинні і
>гуморальние.

2.1. Клітинні чинники

У організмі риб їх подано різноманітними по структурної
організації клітинами: лейкоцитами, макрофагами,ендотелиоцитами тощо. Однією
з основних функцій цих клітин є (фагоцитоз. З іншого боку, вони беруть участь
в синтезі медіаторів імунної системи іантибиотических речовин:лизоцима,
інтерферону,агглютининов,интерлсйки-нов та інших.

2.1.1. >Лейкоцити

>Лейкоцити риб представлені різноманітними структурою і характерові
виконуваної функції клітинами:лимфоцитами,моноцитами,нейтрофилами,
>еозино- ібазофилами. Здебільшого, лейкоцити риб, на відміну вищих
хребетних, представленілимфоцитами, тоді як в теплокровних - клітинами
>нейтрофильного низки. У риб частку лімфоцитів доводиться 45-99 % клітин від
загальної кількості лейкоцитів, а й у вищихпозвоночних-25-30%. У 1 мл крові риб
лейкоцитів міститься у 5-10 і більше разів більше, ніж в людини і тварин.
Кількість лейкоцитів і окремих типів клітин, які його складають, в організмі
риб коливається і від індивідуальних, вікових особливостей, сезону
року, зараженості їх паразитами, присутності воді токсичних факторів, і
умов змісту. На вплив сприятливих і несприятливих чинників
риби реагують інтенсивністюлейкопоеза і зміною співвідношень між
>лимфоцитами ігранулоцитами. У організмі риб, підданих впливу
"агресивних" чинників, збільшується частка змісту клітин
>гранулоцитарного низки (>палочкоядерних,ссг-ментоядернихнейтрофилов і
еозинофілів іаберрантних форм клітин).

Зміни у складі лейкоцитів б'ють по ступеня опірності
риб до інфекційним іинвазионним хворобам. Зниження вмісту
лімфоцитів віддзеркалюється в інтенсивності синтезу антитіл, відторгнення
трансплантату, завершеності фагоцитозу і напруги імунітету до
хворобам. Існують прямий і непрямий способи обліку загальної кількості
лейкоцитів у крові риб. Дослідження проводять у відповідність до
">Методическими вказівками з проведення гематологічного обстеження
риб", затвердженими Департаментом ветеринарії 02.02.99 р., № 13-4-2/1738.


2.1.2.Фагоцитоз

Функціональне стан фагоцитів здебільшого визначається
по фагоцитарної активності лейкоцитів периферичної крові чи клітин,
виділених з головного,туловищного відділів нирок і селезінки. Існують
різноманітні методичні прийоми кількісної оцінки фагоцитарної
активності лейкоцитів. Одні засновані на підрахунку числа фагоцитів з
захопленими чужорідними тілами під мікроскопом, інші - на реєстрації
інтенсивності проявикислородзависимойантиинфекционной системи в
реакціїхемилюминесцснции чи з здібності фагоцитів відновлювати
розчинну барвникнитросинийтетразолий в нерозчиннийдиформазан
(>НСТ-тест). Визначення фагоцитарної активності лейкоцитів in vitro і invivo в
відношенні мікроорганізмів грунтується обліку фагоцитів під світловим
мікроскопом.Хсмилюминесцентний метод визначення фагоцитарної
активності клітин вимагає спеціального дорогого устаткування й
комп'ютерна техніка. Спосіб визначення фагоцитарної реакції лейкоцитів
поНСТ-тесту більш трудомісткий, ніж заснований на використанні тест-
мікроорганізмів. Вивчення фагоцитарної активності лейкоцитів щодо
мікробів на практиці лабораторних досліджень найчастіше проводиться in vitro і
invivo. Яктест-микробов рекомендується використовувати
>грамположителъние іграмотри-цательние мікроби:staphilococcusaureus,
>acromonashydrophila іsaccharomycescerevisiae.

2.1.2.1. Метод визначення фагоцитарної активності лейкоцитів in vitro по
>Е.А. Коста іМ.И.Стенко (1947).

Принцип методу. Зазначений метод грунтується обліку співвідношення числа
лейкоцитів, що у фагоцитоз, і спільного числа клітин білої крові.
- Обладнання ГЕС і реактиви: пробірки стерильні; піпетки стерильні на
1,0 мл;пастеровские піпетки стерильні;0,65%-ний стерильний розчин натрію
хлориду;2%-ний стерильний розчин натріюцитрата; водяний лазня,
>отрегулированная на60°С; об'єкт фагоцитозу ->одномиллиардная завись добової
культури бактерій a.hydrophila,инактивированних при60°С за тридцяти хвилин,
приготовлений на0,65%-ном стерильному розчині натрію хлориду; термостат
відрегульований на26°С; предметні скла;шли4юваннос скло; набір для
забарвлення мазків крові; метиловий спирт чи суміш етилового спирту з ефіром ]: 1;
робочий розчин барвникаазур-еозина;иммерсионное олію;
мікроскоп.
- Матеріал на дослідження, хід ухвали і облік результатів. У
пробірку вносять 0,1 мл2%-ного стерильного розчину натріюцитрата, (,|,2 мл
>свсжевзятой крові відобследуемой риби, 0,2 мл об'єкта фагоцитозу.Взвесь
обережно, але старанно перемішують і вміщують у термостат за нормальної температури
>26°С (для теплолюбних риб) і перевагу нижчої (дляхолодолюбивих). Через 15 і 30
хвилин, 1; 1,5 і 2 години зтер-мостатированияпастеровской піпеткою
забирають суміш із пробірки, поміщають на предметне скло і роблять мазки,
які фіксують протягом десяти хв. сумішшю спирту з ефіром (1:1) або звільнити протягом
5 хв.метиловим спиртом. Потім мазки фарбують у протягом 20-40 хв. робочим рас-
>творомазур-еозина. Після цього їхні переглядають підиммерсией (>ок.7.xоб.90).
>Подсчитивают 100 (іноді 50) лейкоцитів. Захоплюючу здатність
лейкоцитів висловлюють два показники: відсотком фагоцитозу - відсотковим
ставленням лейкоцитів, котрі захопилитест-микроби, до загальної кількості
підрахованих, іфагоцитарним індексом - кількістютест-микробов,
захоплених однимфагоцитирующимлейкоцитом.

2.1.2.2. Метод визначення фагоцитарної активності лейкоцитів invivo по
>Г.Д.Гончарову (1966)
- Принцип методу залежить від дослідженні реакції фагоцитозу
лейкоцитів в черевної порожнини риб. Аналіз фагоцитарної реакції, проводиться
через 15, 30, 60, 90 і 120 хв, із моменту введення мікроорганізмів
- Обладнання ГЕС і реактиви: шприц і ін'єкційні голки;0.65%-ний
стерильний розчин натрію хлориду; водяний лазня,отрегулированная на60°С;
>одномиллиардная завись добової культури бактерій А.hydrophila,
>инактивированной при60°С за тридцяти хв.; термостат, відрегульований на
>26°С;пастеровские піпетки стерильні; предметні скла;шлифованное скло;
метиловий спирт чи суміш етилового спирту з ефіром 1:1; робочий розчиназур-
>еозина;иммерсионное олію; мікроскоп.

- Матеріал на дослідження, хід ухвали і облік результатів. Рибам
міжбрюшними плавникамивнутрибрюшинно вводять вказане кількість
>инактивированних мікробних тіл на0,65%-ном стерильному розчині натрію
хлориду, поміщають в акваріум і крізь 15 і 30 хв., 1, 1.5 і 2 години з
запровадження об'єкта фагоцитозу у рибпастеровской піпеткою відбирають з місця
уколу черевноїекссудат, завдають на предметні скла і роблять мазки.
Отримані мазки фіксують протягом десяти хв, сумішшю спиртуректификата з
ефіром (1:1) або звільнити протягом 5 хв.метиловим спиртом. Потім мазки фарбують у
протягом 20-40 хв. робочим розчиномазур-еозина і досліджують під мікроскопом
(>ок.7 xоб.90).Подсчитивают 100-200 лейкоцитів. Оцінку проводять аналогічно
методуЕ.А. Коста іМ.И.Стенко.


2.2.Гуморальние чинники

До гуморальним чинникам імунітету риб відносять різноманітні по
структурі та імунобіологічної функції компоненти, що входять до склад
крові, лімфи, тканинних рідин, шкірної і кишковій слизу:
>лизоцим, комплемент,агглютинини (природні антитіла),интсрфе-рон,
>лсктини,трансфсрини,лизини,бактериолизини,С-реактивний білок,хитиназа і
т.д.

Нижче наведені методи визначення бактерицидних властивостей сироватки
крові (>БАСК), комплементу, інтерферону природничих антитіл чи
>агглютининов, найбільш об'єктивно що відбивають функціональне стан
імунної системи та рівень природноюрезистент-ности риб.

2.2.1. Визначення бактерицидною активності сироватки (>БАСК)
крові риб

>БАСК відбиває функціональне стан гуморальних чинників захисту
чи природноюрезистснтности. Цей показник використовують в оцінці
характеру течії інфекційного процесу, зараженості риб паразитами і
умов нагулу. Для урахування розміру антимікробних властивостей сироватки крові
рекомендується використовувати радіовуглецевий іфотоелсктронефелометрический
способи. Коли щодо оцінкиБАСКрадиоуглсродним способом потрібно
спеціально пристосоване цієї мети устаткування рекомендується
користувати оптичний метод (>О.В.Смирнова,Т.А.Кузьмина, 1966),
адаптований для риб (>Микряков та інших. 1979: Зимін, 1983).

Принцип методу грунтується обліку характеру зміни оптичної
щільностіМПБ чиРПБ у разі зростання у ньому мікробів з додаванням чи ні
додаванняиспитуемой сироватки з допомогою фотоелектричногоколориметра
чиспектрофотометра.

Обладнання ГЕС і реактиви: піпетки стерильні на 1,0 мл;МПБ чиРПБ
стерильний в пробірках по 2,5 і 3,0 мл чи з 5,0 і 6,0 мл; сироватка крові
досліджуваних риб;одномиллиардная завись добової культуривирулентних
бактерій a.hydrophila (можна скористатися й іншими види мікроорганізмів),
приготовлений на0,65%-ном стерильному розчині натрію хлориду; термостат,
відрегульований на26°С;ФЭК-56М;пастеровские піпетки, шприци і
ін'єкційні голки для взяття крові, стерильні.

Матеріал на дослідження, хід ухвали і облік результатів. Оцінку
>БАСК проводять у протягом 1-5 діб від часу взяття крові. Кров щоб одержати
сироватки складають у стерильні пробіркикаудоекгомией, відсіканням
зябрових артерій або з кровоносних судин хвостового стебла з допомогою
>пастеровской піпетки чи шприца. Отриману кров відстоюють при кімнатної
температурі 20-30 хвилин. Після обведення згустку крові за допомогою стерильною
>пастеровской піпетки пробірки ставлять у холодильник на 18-24 години при + 4° З.
За добуотделившуюся в пробірках сироваткупастеровскимипипетками
відсмоктують і переносять в стерильні пробірки. Далі сироватку
>центрифугируют при 3000 об./хв, протягом 10-15 хвилин й використовують для
постановки досвіду. У пробірки вносять 2,5 млМПБ чиРПБ і 0,5 млиспитуемой
сироватки, а три контрольні пробірки 3,0 мл середовища. Потімпастеровской
піпеткою в усі пробірки додають по 2 крапліодномиллиардной суспензії
добової культури тест - бактерій. Вміст пробірок старанно
перемішують, відбирають по 3.0 мл суміші визначають оптичну щільність на
ФЕК. Після цього проби вміщують у термостат при26°С на 3 години, після чого
знову вимірюють оптичну щільність їх вмісту. У пробірках з активною
сироваткою крові оптична щільність залишається колишньому рівні чи
незначно підвищується. За слабкої бактерицидною активності сироватки
оптична щільність середовища зростає з допомогою накопичення у ній розмножуються
мікробів. У контрольних пробірках оптична щільність середовища зростає.
>БАСК висловлюють через зміни оптичної щільності контрольних і
піддослідних проб, відбиваютьугнстсние зростання бактерій у присутності
сироватки, й сподіваються за такою формулою:


>БАСК(%) = 100 x ->dek ~ de ° ,

 де de,dЕк - різницю оптичної щільності другого і першого до
контрольних пробірках;deo - різницю оптичної щільності другого і першого вимірів оптичної щільності у дослідних пробірках.
>100-коеффициснт перекладу оптичної щільності в %.


2.2.2. Визначення гемолітичної активності комплементу

Яктест-объекта визначення активності комплементу in vitro
використовують еритроцити барана (класичним шляхом) і еритроцити кролика (по
альтернативного шляху).

Активність комплементу зазвичай виявляється у умовних одиницях. Уже за
50 %гемолитическуго одиницю (>СНад) приймається кількість комплементу,
необхідне 50 %-го лізису еритроцитів. Ця одиниця є умовної,
оскільки залежить від концентрації еритроцитів, кількостісенсибилизирующих
антитіл (для класичного шляху), величини іонної сили середовища, концентрації
>Са^ іmg21,ph, часу й температури реакції. До кожного виду риб
підбираються оптимальні значення цих показників.

Ставлення між кількістю взятого комплементу та чималою часткоюлизи-рованних
клітин нс є лінійним, а виражається сигмоподібної кривою, для
математичного описи якої використовується рівняння:


Х = До (>y/l-y)17"

де: Х - кількість комплементу (мл) у реакції; у - ступінь лізису, котре виражається у
частках одиниці; До -константа, відповіднаichso при у = 0,5;1/п-константа
(визначає нахил кривою, залежить та умовами досвіду).

Прилогарифмировании цього рівняння виходить функція, зручна для
оцінки результатів:

>igx =>lgk+l/n[lg(y/l-y)]

Залежність величиниlg Х від величиниlg(y/l-y) графічно буде
представляти пряму лінію, якими можна визначити потрібну величину До.
Знаючи величину До, легко розрахувати кількістьchsn, які у 1 мл
>неразведенной сироватки.


2.2.2.1. Визначення гемолітичної активності комплементу по
класичному шляху активації (метод Мейєра в модифікаціїyano Т.,
1992).
- Принцип методу грунтується на здібності комплементуприсоеди-
>няться до комплексу антиген - антитіло (еритроцити барана -гемолизин) і
>вьвивать специфічнийгемолиесенсибилизированних еритроцитів.

За одиницю активності (по Мейєру) комплементу теплокровних
приймають стількинеразведенной сироватки, що викликає
50 %лизис5х108 оптимальносенсибилизированних еритроцитів барана в
желатин -вероналовом буфері (рН 7,4), що містить 0,15mmСа2* і 0,5
>mmmg24", протягом 60 хв інкубації при 37° З обсягом 7,5 мл. По
>yano Т., залежно від виду риб,инкубацию здійснюють при 20- 25°
З протягом 60-120 хв вжелатин-вероналовом буфері (рН 7,3 -7,4),
що містить 0,5mmСа2^ і однуmmmg^ обсягом 1,5 мл. Длясенси-
>билизации еритроцитів використовуютьгемолизин тієї самої (чи близького)
виду риб, як і випробовуваний комплемент.

- Обладнання ГЕС і реактиви:спектрофотометр ікювети із довжиною
оптичного шляху 1 див (під час використання приладів з іншою довжиноюопти-
>ческого шляху необхідно знайти й залучити до розрахунках величину
оптичної щільності (>od) для заданої концентрації еритроцитів);
рН - метр; водяний лазня;дозирующиемикропипетки на 0,2; 1, 2 мл; про-
бирки (5-10 мл), що витримують центрифугування;рефрижераторная
центрифуга; стерильні шприци; глюкоза;naci; дистильована вода;
>na-5,5,-диетилбарбитурат (>мединал);cacl2;mgcl2; желатин; inhc1;
крижана оцтової кислоти; ацетат натрію;edta; 10 %МаЖ)з; еритроцити
барана в розчиніОлсвера (1:1);гемолизин;сиворотка крові

Страница 1 из 4 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація