Реферати українською » Медицина, здоровье » Збір та зберігання матеріалу, кількісне визначення 17 - КС по реакції Циммермана


Реферат Збір та зберігання матеріалу, кількісне визначення 17 - КС по реакції Циммермана

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Збір і збереження матеріалу, кількісне визначення 17 – КС за реакцієюЦиммермана


1.Надпочечники

>Надпочечники - невеликі парні органи внутрішньої секреції, які працюють узабрюшинном просторі над верхніми полюсами нирок, є ендокринну залозу. Відрізняються формою: правий трикутний, а лівий у вигляді – півмісяця. Середній вагу однієї залози 3,5 – 5 р. Коженнадпочечник складається з внутрішнього мозкового шару і зовнішньогокоркового речовини, кожен із якого є своєю чергою самостійної ендокринної залозою. Вони відрізняються одна від друга будовою, секрецією різних груп гормонів і походженням.

Гормони, віднайдені вкорковом речовині, ставляться докортикостероидам. Сама кора надниркових залозморфо–функционально складається з трьох верств:

>клубочковая зона

сітчаста зона

пучкова зона

Уклубочковой зоні утворюютьсяминералокортикоиди: альдостерон,кортикостерон,дезоксикортикостерон. Вони підвищуютьреабсорбцию натрію і виділення калію в нирках.

Упучковой зоні утворюютьсяглюкокортикоиди:кортизол,кортикостерон.

>Глюкокортикоиди мають істотний дію на всі процеси обміну речовин. Вони стимулюють освіту глюкози з жирів і амінокислот (>глюконеогенез), пригнічують запальні, імунні й алергічні реакції, зменшують розростання сполучної тканини, підвищують чутливість органів почуттів та збуджуваність нервової системи. У сітчастою зоні виробляються статеві гормони – андрогени, можуть бути речовинами - попередниками естрогенів. Їх роль: вони активні до статевого дозрівання і після дозрівання статевих залоз, зокрема впливають в розвитку вторинних статевих ознак. Клітини мозкового речовини надниркових залоз виробляють катехоламіни - адреналін і норадреналін. У стані спокою вони постійно виділяють небагато катехоламінів. Під упливом стресовій ситуації продукція катехоламінів значно зростає. Крім катехоламінів клітини мозкового шару надниркових залоз виробляють пептиди, виконують регуляторну функцію в ЦНС іЖКТ. Серед цих речовин: речовина Р,интестинальнийвазоактивний пептид,соматостатин, бета –енкефалин.

2. 17 –кетостероиди (17 – КС)

 

Викликавши біологічний ефект,кортикостероиди, піддаютьсякатаболическим перетворенням у печінці. У цьому відбувається окислювання бічний ланцюга, церкви, розміщеної у структурі молекули гормону у 17 – го атома вуглецю, у результаті утворюються 17 – КС. Ще замалий вплив 17 – КС мають надниркова походження, чоловіки – 2/3 утворюються з допомогою гормонів кори надниркових залоз, 1/3 – з допомогою – стероїдів сім'яників (тестостерону),синтезирующихся винтерстициальних клітинах чоловічих статевих залоз. Період піврозпаду тестостерону становить кілька десятків хвилин. Дорослі чоловіків зі сечеюекскретируется трохи більше 1%неизмененного тестостерону, що свідчить про його розпаді у печінці до кінцевих продуктів обміну.

Невелика частина 17 – КС (близько 15%) є метаболітами в реакціях освітиглюкокортикоидних гормонів (>кортизол, кортизон, 11 –>дезоксикортизол). Основну фракцію 17 - КС в сечі представляє дегідроепіандростерон – сульфат іепиандростерон з надниркових залоз, і навіть метаболіти тестостерону (його попередники і похідні –андростендион,андростерон,етиохоланолон,епиандростерон), які утворюються в яєчках. Вони виводяться з сечею як продуктів обміну.

Цілі дослідження 17 – КС в сечі:

>1.оценка функціонального станукоркового речовини надниркових залоз

>2.диагностика синдрому Кушинга, хвороби Аддісона,адреногенитального синдрому, пухлини яєчка і яєчника.

Підготовка до дослідження: Пояснити пацієнтові мети дослідження. Яких – або обмежень у дієті і режимі харчування непотрібен, проте пацієнтові слід уникати надмірних фізичні навантаження і емоційних стресів під час збирання сечі. Пацієнту повідомляють, що з аналізу використовують добову сечу, і пояснюють, як його зібрати. Співробітники лабораторії і лікар ж повинні знати, чи приймає пацієнт препарати, які вплинути на результат аналізу (деяких випадках від застосування необхідно утриматися).

Процедури:

>Мочу складають у спеціальний контейнер протягом 24-х годин, у своїй першу (ранкову) порцію сечі зливають, а останню зберігають для аналізу. Задля підтримки рН 4,0 – 4,5 в контейнер додають консервант. Під час період збору сеча зберігається не в холодильнику на нижньої полиці. Після закінчення збору, старанно перемішується, на другий контейнер наливають 100 -200 мл перемішаної сечі і доставляють до лабораторії.

Хід дослідження

>1.Экстракция. Для екстракції використовуютьнесмешивающиеся із жовтою водою розчинники, у яких переходятьекстрагируемие речовини. У цілому нині що більше векстрагируемом речовині полярних груп (>оксо - ,окси - ,альдегидних …), краще воно перетворюється нанесмешивающиеся із жовтою водою полярні розчинники – вищі спирти,етилацетат. Чим менший полярних груп, тим більше коштів підходятьнеполярние розчинники –гексан, хлороформ. Ефір займає проміжне становище. Ефективність екстракції залежить від рН водного розчину та змісту солей. Найефективніше екстракція відбувається, якщо спочатку утворюється одна фаза, які потім поділяється на дві при додаванні надлишку однієї з інгредієнтів, але такі умови вдається підібрати який завжди, значно частіше простовстряхивают двінесмешивающиеся рідини. Обсяги фаз після екстракції часто-густо відповідають обсягам узятих розчинів і розчинників, т до разом ізекстрагируемим речовиною до іншої фазу часто переходить і частина розчинника і навпаки; це надзвичайно утрудняє точний відбіраликвоти з якої – або фази. Якщо речовина поганоекстрагируется, часто використовують повторну екстракцію тим самим розчинником, та був обидва екстракту змішують. Важливо під час проведення екстракції стежити, ніж утворилася стійка емульсія, що заважає поділу фаз. Це від домішок, тому потрібно струшувати обережно, до того ж час досить енергійно, щоб настало рівновагу. Освіті емульсії перешкоджає збільшення освіти солі в розчині, емульсію можна спробувати розділитицентрифугированием. Можна проводити екстракцію в ділильних лійках, конічних колбах чи пробірках зпришлифованними скляними чи поліетиленовими кришками. Якщо працюють із колбами, треба використовувати магнітні мішалки. Працюючи з пробірками їхвстряхивают вручну чивстряхивателе (>шюттель), пробірки зручні тим, що й утворюється емульсія, яку можна дозволитицентрифугированием. Після екстракції один шар відділяють від іншого, зазвичай значна полегкість відсмоктати верхній шар і кількісно перенести їх у чисту посуд, ніж нижній. Зручно відсмоктуватипастеровскимипипетками з грушею, переносячи верхній шар невеликими порціями, у своїй, коли з помилці буде захоплена невеличка порція нижнього шару, її легко повернути до місце.

3. Очищення етанолу

Абсолютний етанол готують з 90 – 96 % етилового спирту шляхом кип'ятіння зСаО чиВаО на водяній бані з електропідігріванням зі зворотним холодильником до того часу, поки точка кипіння стане 78,3 З нормальногобарометрическом тиску.    

Виявлення альдегідів: до 5 мл етанолу додають 0,2 мл розчину калію перманганату, що містить 200 мг один л (1 : 5000), розчин ніобесцвечиваться протягом 20 хвилин. Зміна забарвлення свідчить про присутність альдегідів. Харчовий спирт містить більше альдегідів, ніжгидролизний.

Способи видалення альдегідів:

1. З двох, 4динитрофинилгидрозином. До 1 л етанолу додати 2 р гідрохлориду 2, 4динитрофинилгидрозина і 0,5 мл концентрованої соляної кислоти, закривають корком і вони залишають стояти2суток у темряві, потім переганяють.

2. З нітратом срібла. У 100 мл гарячого етанолу розчиняють 7 р нітрату срібла і додають туди 15 р їдкого калію, розчин виливають на чотири л що підлягає очищенні етанолу.Випадает темний осад, що поступово осідає на дно. За добу його відокремлюють фільтруванням, етанол переганяють, відкидають першу і останню порції.

>3.Очистка хлороформу ідихлорметана.

Для визначення гормонів найкраще використати хлороформ марки «для наркозу», у якому небагато спирту, що робить її біліша стабільним. Задля чистоти хлороформу інших марок, і навіть для регенерації тих порцій розчинника, у яких одного разу використовувалися для екстракції гормонів, їх збовтують з концентрованої сірчаної кислотою протягом 1 – 2 робочих днів, у своїй сірчана кислота темніє то швидше, ніж біліша забруднене розчинник.Встряхивание проводиться у темряві, зручно користуватися магнітноїмешалкой, закриваючи колбусветонепроницаемим ковпаком. Після цього кислоту відсмоктують, хлороформ промивають водою, та був протягом кількох годин концентрованим розчином аміаку, 1 звгидроксидом натрію чи насиченим розчином натрію карбонату, потім знову промивають водою і осушують безводним натрію сульфатом чи натріюкарбонатом. Після осушення розчинник переганяють, використовуючи скляний дистилятор нашлифах, нагрівач – електричний із шумоізолюючою водяною лазнею. Конкретний режим очищення залежить від якості вихідного розчинника. Про ефективність очищення найкраще судити, поставивши холостий чикалибровочний досвід.

4. Очищення ефіру

Для видалення перекисів ефір збовтують з десятьма % розчином сульфіду заліза (2) один зв сірчаної кислоті, потім промивають водою. Перевірка наявності перекисів: 200 мл ефіру випарюють, залишок розчиняють у два мл абсолютного етанолу. Із цієї кількості відбирають 0,2 мл, яких додають 0,2 мл 2 % спиртового розчинуметадинитробензола і 0,2 мл 5 зв розчину їдкого калію вметаноле. Забарвлення має перевищувати тієї, яка розвивається при додаванні до тих жреактивам 5 мкг кристалічногокетостероида.

5. Визначення змісту 17 – КС в сечі за реакцією зметадинитробензолом (реакціяЦиммермана в модифікаціїКреховой).

Принцип методу: кількісне встановлення змісту специфічно забарвлених у фіолетовий колірекстрагированниххромогенов, які виникають внаслідокреакции17 – КС зметадинитробензолом в лужної середовищі.    

>Реактиви:

>1.диетиловий (медичний) ефір, вільний від перекисів

>2.абсолютний етанол, очищений від альдегідів ікетонов - див вище

>3.концентрированная соляна кислота, 1,19кг/л

>4.ледяная оцтової кислоти

>5.раствор їдкого натра, 100 г/л

6.5 зв. розчин їдкого калію вметаноле (застосовуваний у ролі розчинника метанол робить реактив стабільнішим, збільшуючи його зберігання). 28 р їдкого калію доводять до 100 мл метанолом, після чого розчин негайно фільтрують (в спиртовому розчині луги утворюютьсяжелто-окрашенние продукти, що зумовлюють високі значення абсорбції контрольної проби). Після фільтрування розчин лугититруют 0,1 зв. соляної кислотою з індикаторомметилоранжем.Реактив бережуть у темнійзапарафинированной склянці не в холодильнику. Він придатний до $1,5 міс.

>7.спиртовой розчинметадинитробензола, 20 г/л.

Перед використанням перевірити чистотуметадинитробензола: 400 мг реагенту розчиняють в $ 20 мл абсолютного етанолу, вона повинна давати забарвлення протягом 1 години після додатку щодо нього рівного обсягу 3 зв. розчину їдкого калію. Інакше реактивперекристаллизовивают.

>Перекристаллизацияметадинитробензола: 10 р його препарату розчиняють в 375 мл 96 % етанолу та нагрівають до 40 З. До розчину доливають 50 мл 2 зв. їдкого натра і суміш залишають п'ять хвилин. Потім її охолоджують і додають до неї при помішуванні 1,25 л дистильованої води. Розчин фільтрують через вирву Бюхнера і промиваютьметадинитробензол на фільтрі абсолютним етанолом (1 раз – 60 мл і 2 разу – по 40 мл).Кристаллизацию слід здійснювати нас дуже швидко, щоб утворювалися дрібні кристали, т. до. великі погано розчиняються в спирті. Отримані дрібніигловидние кристали повинен мати зазначену температуру плавлення.Спиртовой розчинметадинитробензола тримають у темній склянці з притертої корком8.метанол9.хлороформ («для наркозу»)10.раствор формальдегіду, 400 г/л (формалін). Розчин розводять у відсотковому співвідношенні 1 : 5 дистильованої водою.11.стандартниерастворикетостероидов, отримані з кристалічнихдегидроепиандростерона іандростерона. Стандартні розчини у концентрації 100мкг/мл , навіщо 5 мгдигидроепиандростерона чиандростерона розчиняють в 50 мл абсолютного етанолу. Зберігають у холодильнику у темній склянці з притертої корком, еталон стійкий протягом кількамісячної. Хід визначення: включає у собі кілька етапів.

1 етап.Гидролиз сечі. До вміщеним в конічну (на 100 мл) колбу 20 мл сечі, взятій з його добового кількості, додають 3 мл концентрованої соляної кислоти, 1 мл крижаної оцтової кислоти і 0,2 мл розчину формальдегіду. Вміст колби перемішують, накривають її воронкою і ставлять у киплячу водяну лазню на 15 хвилин. Після цього колбу охолоджують під струменем холодної водогінної води та вміст її переносять вделительную вирву. 

2 етап.Экстракция очищення екстракту (ввозятьсяделительной воронку).Экстракцию виробляютьдиетиловим ефіром (2 разу по 10 мл) протягом 1 – 1,5 хвилин. Нижній шар сечі видаляють.Эфирние екстракти об'єднують, промивають трьома порціями по 10 мл розчину їдкого натра (по 3 хвилини). Водну, що містить естрогени та інші речовини кислого характеру, лужну фазу прибирають і екстракт промивають 1 раз 10 мл дистильованої води. Воду старанно відокремлюють, ефірний екстракт порціями переносять вцентрифужную пробірку і випарюють на теплою (з температурою не вище 50 З) водяній бані. Сухі екстракти (приформальдегидном способі повинно бути безбарвні) цьому етапі можна до наступного дні, у холодильнику.

3 етап. Кількісне визначення поЦиммерману в модифікаціїКреховой.

До сухого залишку доливають 0,2 мл абсолютного етанолу, 0,2 млметанольного розчину їдкого калію і 0,2 мл спиртового розчинуметадинитробензола. Вміст пробірки старанно перемішують і вони залишають у розвиток забарвлення на 1 год (у темряві!!!) при кімнатної температурі. Після закінчення інкубації додають 3 мл водного розчину етанолу (500 г/л) і 2 мл хлороформу, суміш енергійновстряхивают.Окрашенние в фіолетовий (ліловий) колір продукти переходить до нижній,хлороформенний шар, а продукти з неспецифічної забарвленням –желто – коричневої чи коричневої – залишаються у верхньомуспиртоводном шарі. За кілька хвилин верхній шар видаляютьотсасиванием (>пастеровской піпеткою). Робити це потрібно акуратно, старанно збираючи краплі водного шару зі стінок пробірки, не засмоктуватихлороформенний шар.

Ухлороформенний шар додають 1 мл абсолютного етанолу. Після перемішування інтенсивність забарвлення розчину вимірюють нафотометре з зеленим (500 –560нм) світлофільтром в кюветі на п'ять мм. Результати порівнюють із аналогічними даними контрольної проби. Забарвлення стабільна протягом години, та був інтенсивність її знижується: через 1 год вона є слабше вже в 10 – 15%. У зв'язку з цим одне визначення припустимо брати трохи більше 10 – 15 проб.

Приготування контрольної проби: на два пробіркиприлить по 0,2 мл абсолютного етанолу, по 0,2 млметанольного розчину їдкого калію і з 0,2 мл спиртового розчинуметадинитробензола. Вміст пробірки перемішують й похоронну справу обробляють як досвідчену пробу.

Розрахунок ведуть за такою формулою чи каліброваному графіку. Для отримання даних розрахуватися за такою формулою паралельно досвідченим пробам через процедуру аналізу пропускають 0,5 мл основного стандартного розчину, що містить 50 мкгандростерона чидигидроепиандростерона.

Для отримання даних побудуватикалибровочного графіка крізь ці етапи аналізу проводять стандартний розчинандростерона (>дигдроепиандростерона) у кількості від 0,1 до 1,0 мл основного розчину.Линейная залежність зберігається до концентрації стандартного розчину 100мкг/мл (100 мг/л).Экскрецию 17 – КС з сечею розраховують за такою формулою:

Х (>мг/сут) = А >оп *d * 50 /А ст * 20 *

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація