Реферати українською » Медицина, здоровье » Антитіла молока и Сироватко крові людини: характеристика каталітічної актівності та Вплив на ріст и виживаності клітін


Реферат Антитіла молока и Сироватко крові людини: характеристика каталітічної актівності та Вплив на ріст и виживаності клітін

Страница 1 из 3 | Следующая страница

>НАЦІОНАЛЬНААКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

>ІНСТИТУТБІОЛОГІЇКЛІТИНИ

>КІТЮРІЙЯРОСЛАВОВИЧ

>УДК 577.112.7: 576.32/36

>АНТИТІЛАМОЛОКА ІСИРОВАТКИКРОВІЛЮДИНИ: ХАРАКТЕРИСТИКАКАТАЛІТИЧНОЇАКТИВНОСТІ ТАВПЛИВ НАРІСТ ІВИЖИВАННЯКЛІТИН

03.00.11 –цитологія,клітиннабіологія,гістологія

>АВТОРЕФЕРАТ

>дисертації наздобуттянауковогоступеня

докторабіологічних наук

Львів – 2008


>Дисертацієюєрукопис

>Роботувиконано вІнститутібіологіїклітини НАН України та уНовосибірськомуінститутібіоорганічноїхімії СВ РАН.

>Науковий консультант:член-кореспондент НАН України

докторбіологічних наук,професор,

Стойка Ростислав Степанович,

>Інститутбіологіїклітини НАН України,

>завідувач відділеннярегуляції

>проліфераціїклітин таапоптозу.

>Офіційніопоненти: докторбіологічних наук,професор,

>СибірнаНаталіяОлександрівна,

>Львівськийнаціональнийуніверситет

>іменіІвана Франка,

>завідувачкафедрибіохімії;

докторбіологічних наук,

>Скок МаринаВолодимирівна,

>Інститутбіохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

>головний науковийспівробітник

відділеннямолекулярноїмунології;

докторбіологічних наук,

>Заставна ДанутаВолодимирівна,

>Інститутспадковоїпатології АМН України,

>завідувач відділеннядіагностикиспадковоїпатології.

>Захиствідбудеться «11»червня 2008 р. про «1400»годині назасіданніспеціалізованоївченої заради Д 35.246.01 вІнститутібіологіїклітини НАН України (79005, м. Львів,вул. Драгоманова, 14/16).

Здисертацією можнаознайомитись убібліотеціІнститутубіологіїклітини НАН України заадресою: 79005, м. Львів,вул. Драгоманова, 14/16.

>Авторефератрозісланий «8»травня 2008 р.

>Вченийсекретар

>спеціалізованоївченої заради,

кандидатбіологічних наук В.М. Убийвовк


>ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКАРОБОТИ

>Актуальність тими.Імунна системассавців не лишезабезпечує захисторганізму відшкідливихчинниківоточуючогосередовища, але й ібере доля врегуляціїбагатьохбіологічноважливихфункцій, котріпідтримують гомеостазорганізму.Гуморальнаімунна системафункціонує черезпродукціюмільйонівваріантів молекулантитіл (АТ),направлених якпротичужоріднихантигенів, то йпротиантигеніввласногоорганізму (>аутологічнихантигенів).Аутологічніантитіла (>ауто-АТ) зспорідненістю дорізноманітнихбіомолекул (>білків,нуклеїнових кислот,полісахаридів,ліпідів) було бвиявлено як ухворих нааутоімуннізахворювання, то й вклінічноздорових людей. Уостанніх описанодвірізновидностіауто-АТ:поліреактивніауто-АТ (>Avrameas et al., 1995) таанти-ідіотиповіауто-АТ (>Jerne et al., 1985).Поліреактивніауто-АТ (>полі-АТ)сироваткикровілюдини,головним чином,представлені IgM чиімуноглобулінамиіншихізотипів, щосекретуютьсяособливоюпопуляцієюВ-лімфоцитів, наповерхні якіприсутнійбілокCD5 (>CD5+-B-лімфоцити).Полі-АТє продуктаминедиференційованихгенівімуноглобулінів йхарактеризуютьсянизькоюафінністю таполіспецифічністю (>спорідненістю доструктурно-відміннихантигенів).Поліспецифічністьцихауто-АТвизначає їхніподвійнуфізіологічну рольорганізміссавців. З одного боці,полі-АТзабезпечуютьпервиннуімуннувідповідьорганізму надіючужоріднихантигенів, а ізіншого боці, черезспорідненість доаутологічнихантигенівціантитіламожуть бутизадіяні урегуляцію гомеостазу.

>Другоюрізновидністюауто-АТ, котріпродукуються внормі,єантиідіотипові АТ (>аі-АТ). Уосновіпродукціїаі-АТлежитьздатністьімунноїсистемиссавцівсприймативаріабельні ділянкивласнихантитіл (>ідіотипи) якчужорідніантигени йпродукувативторинніантитіла (>аі-АТ),специфічні доцихфрагментівантитіл. Черезрецептор–опосередкованувзаємодію зімунокомпетентнимиклітинамиаі-АТберуть доля вклональнійселекціїлімфоцитів ворганізміссавців.Згідно ізциммеханізмом,співвідношенняміжпервиннимиантитілами йаі-АТрегулюєімуннувідповідьорганізму начужорідніантигени.Характерноюознакоюаі-АТєїхнявисокаспецифічність доантигеннихдетермінантантитіл.

Навідміну відауто-АТклінічноздорових людей,ауто-АТ,виявлені ворганізміхворих нааутоімуннізахворювання,володіютьвисокоюспецифічністю йвисокоюспорідненістю доаутоантигенів. При цьомуантигеннаспецифічністьауто-АТбезпосередньопов’язана із типомзахворювання таособливістю йогоперебігу. Черезвзаємодію заутоантигенамиауто-АТ,безпосередньо чиопосередковано,можутьбрати доля врозвиткуаутоімуннихзахворювань, щодозволяєвважати їхньогомолекулярними маркерами,придатними длядіагностикиаутоімуннихзахворювань тапрогнозуванняособливостейїхньогоперебігу упацієнтів.

>Імунний статусорганізмувагітнихжінок йпородільмає рядсуттєвихвідмінностей від нормального стану. З одного боці,цепов’язанозізмінами ворганізмівагітноїжінки,скерованими на забезпеченняімунноїтолерантностіщодоклітинорганізму плоду, а із іншого боці,цепов’язано зособливістюфункціонування гуморальногоімунітету упороділь,який напрямів на забезпеченняімунногозахистуновонароджених та нарозвитокїхньоївласноїімунноїсистеми.

>Відомо, щозміни у гормонального таімунномустатусіжінок,пов’язані ізвагітністю,пологами талактацією,можутьпризводити дорозвиткуаутоімуннихзахворювань (>Сervera et al., 2002;Molokhia et al., 2008).Внаслідокпорушенняаутоімунноїтолерантності ворганізміжінкиз’являютьсявисокоспецифічніауто-АТ таабзими,характерні дляхворих нааутоімуннізахворювання (>Buneva et al., 2003).

Таким чином,дослідженняантигенноїспецифічності тафункціональноїактивностіауто-АТ, котріпродукуються внормі, приаутоімуннихзахворюваннях, атакож привагітності йлактації,єактуальними,оскільки смердотідозволяютьвиявитимолекулярнімеханізми,залучені урозвитокаутоімуннихпроцесів ворганізмілюдини.

>Компоненти молозива та молокажінокдіють нелише якфакторитрофічного забезпеченнядитини, але й і якчинникирегуляціїрозвиткудитячогоорганізму.Ключову роль утакійрегуляціївиконуютьбілки молока, котріможутьвпливати напроліферацію,диференціацію та апоптозклітинрізнихтипів.Цитокіни,зокремаінтерферон йдеякіфактори зростанню, уневеликійкількостіприсутні умолоці йсироватцікрові (>Канишкова таін., 2003).Іншібілки, котрізадіяні урегуляціїклітинноїактивності,зустрічаються,переважно, ужіночомумолоці. Доцихбілків,наприклад,належитьальфа-лактальбумін,олігомерніформиякогоздатнііндукувати апоптозпухлиннихклітин уприсутностііонівкальцію (>Hakansson et al., 1995), талактоферин,який,залежно віднаявностііонівзаліза,здатнийрегулюватипроліферацію,диференціацію чи апоптозрізного типуклітин (Legrand et al., 2008).

Ос-кількилактаціяєчастиною репродуктивного циклужінки,функціональнаактивністьімуноглобулінів молозива та молокаможевідображатиіндивідуальніособливості стануїї гуморальногоімунітету. Ужіночомумолоцівиявленополі-АТ (>Vassilev et al., 1996) тависокоспецифічніауто-АТ,характерні дляхворих нааутоімуннізахворювання (>Brenner et al., 1992;Askanase et al., 2002). Останніможуть бутизадіяні урозвиткуаутоімуннихпроцесів удитини.

>Важливоюфункціональноюособливістюауто-АТ,виявлених внормі та припатології,єїхняздатністькаталізуватихімічніреакції.Каталітичноактивніауто-АТотрималиназвуабзимів.Абзими,подібно доауто-АТ,виявлених ворганізміссавців, можнарозділитищонайменше на дватипи –абзими, котріє продуктаминедиференційованихгенівімуноглобулінів (>Paul et al., 2005), таабзими, котріутворюютьсявнаслідокмолекулярноїмімікріїантигенів. Останнівідносяться доаі-АТ, котріпродукуються за умів, колиантигеннимидетермінантамивиступаютьполіпептидні ділянки, котріформуютькаталітичніцентриензимів (>Gabibov et al., 2006).Функціїабзимів ворганізмілюдинививченінедостатньо.Аналізлітературнихданихвказує тих, щоперший типабзимівможебрати доля взнешкодженнівірусних табактеріальнихантигенів ворганізміклінічноздорових людей, адругий типабзимівможе бутизадіяний урозвиткуаутоімуннихзахворювань.

Умолозиві тамолоціклінічноздоровихпородільприсутніобидватипиабзимів. перший тип (>абзими зфосфотрансферазноюактивністю) було бвиявлено лише умолоціжінок (>Kit et al., 1991, 1995;Gorbunov et al., 2000, 2005;Karataeva et al., 2005), тоді якдругий тип (>абзими згідролізуючоюактивністю)присутні як умолоціклінічноздоровихпороділь, то й усироватцікровіхворих нааутоімуннізахворювання (>Nevinsky et al., 2002, 2003). Ос-кількифункціяцихабзимів ворганізмізалишається нез’ясованою,дослідження їхньогобіологічноїактивностієважливим длярозумінняособливостейфункціонування гуморальногоімунітету ужінок под годинувагітності йлактації.

>Усевищесказанесвідчить проактуальністьдослідженняантигенноїспецифічності йкаталітичноїактивностіантитіл, атакожвивченнявпливуцихантитіл наріст йвиживанняклітин.

>Зв’язок роботи ізнауковимипрограмами й планами.Роботу було брозпочатовідповідно допланівнауково-досліднихробітлабораторіїрадіохіміїНовосибірськогоінститутубіоорганічноїхіміїСибірськоговідділення Ро-сійськоїАкадемії наук умежах напрямі “>Биокатализ, структура й третя функція гена”упродовж 1994-1999 рр.Пізнішеїї було бпродовжено увідділірегуляціїпроліфераціїклітин таапоптозуІнститутубіологіїклітини НаціональноїАкадемії наук України вмежах тими «>Дослідженняпроцесів, щовідбуваються под годинуапоптозу,індукованогоантинеопластичними препаратами ізрізниммеханізмом дії»упродовж 2006-2008 років (номер державноїреєстрації №0106U002599).Частково роботу було бтакожпідтримано грантомРосійського ФондуФундаментальнихДосліджень затемою: “Роль фосфорилюваннялактальбумина людського молока освіти йогомультимерних форм, спроможних індукувати апоптоз ракових, ембріональних ілимфоидних клітин”, проект 97-04-49931 (1997-1999 рр) та грантомпідтримкиспільнихпроектіввчених НаціональноїАкадемії наук України йСибірськоговідділення Ро-сійськоїАкадемії наук затемою “>Біологічноактивнісполуки молока й їхньогофізіологічніфункції”, проект № 9 (2006-2008 рр), котрі були наданііздобувачу.

Мета й заподіяннядослідженя.Метою роботи було бдослідитивзаємозв’язокміжантигенноюспецифічністю таособливостямикаталітичноїактивностіауто-АТклінічноздорових людей тахворих нааутоімуннізахворювання, атакожвивчитиїхнійвплив наріст йвиживанняклітинссавців in vitro.

Длядосягненняцієї мети було б проведенодослідження у 3-хосновнихнапрямках:

>Порівнятиантигеннуспецифічність такаталітичнуактивністьауто-АТ,виділених зсироваткикровіздоровихдонорів тахворих насистемнийчервонийвовчак йрозсіяний склероз, зауто-АТ,виділеними з молозива та молокаклінічноздоровихжінок.

>Проаналізуватиспорідненістьсинтетичних таприроднихчинників,здатнихутворюватикомплекси зауто-АТсироваткикрові й молокалюдини, тадослідитиїхнійвплив накаталітичнуактивністьабзимів.

>Отриматиочищеніпрепаратиантитіл зрізноюантигенноюспецифічністю зсироваткикрові та молокалюдини йдослідитиїхнійвплив наріст тавиживанняклітин in vitro.

Умежахцихнапрямківдослідження уроботівирішувалинаступні заподіяння:

>Дослідитивпливпрепаратівімуноглобулінів,отриманих зсироваткикровіздоровихдонорів,хворих нарозсіяний склероз й молозивапороділь, наріст йвиживанняклітин in vitro.

>Розробитиметоди очищенняауто-АТ таабзимів зсироваткикрові та молокалюдини.

>Визначитиантиген-зв’язувальні,каталітичні тарегуляторніцентриауто-АТ таабзимів звикористаннямафінноїмодифікації молекул АТреакційноздатними аналогаминуклеотидів таолігонуклеотидів.

>Вивчитизакономірностірегуляціїкаталітичноїактивностіабзимівсироваткикрові та молокалюдини:

а й задопомогоюрізнихречовинбіологічногопоходження (>нуклеотиди, ДНК, РНК,полісахариди,конкурентніінгібіторипротеїназ);

б) задопомогоюсинтетичнихречовин (>модифіковані аналогинуклеотидів таолігонуклеотидів,хімічнімодифікаториамінокислотнихзалишківбілків).

>Встановитизакономірностівпливуауто-АТ таабзимів,виділених зсироваткикровіклінічноздорових людей та молокапороділь, наріст тавиживанняракових йтрансформованихклітин in vitro.

>Об’єктдослідження –аутологічніантитіласироваткикрові й молокалюдини.

Предметдослідження –виявлення й очищенняаутологічнихантитілрізноїантигенноїспецифічності зсироваткикрові й молокалюдини тадослідженняїхньоїфункціональноїактивності,зокрема,впливу наріст йвиживанняклітин.

>Методидослідження. Уроботівикористанометодипрепаративної тааналітичноїбіохіміїбілків йнуклеїнових кислот (>осадженнябілків сульфатомамонію,діаліз,іонообміннахроматографія,електрофорез уполіакриламідному таагарозномугелі,ізоелектричнефокусуваннябілків,високоефективнарідиннахроматографія). Проведенокомп’ютернийаналізрівнягомологіїміжпервинними структурамипротеїнкіназ табілківнадродиниімуноглобулінів.Застосованометодидослідженняцитотоксичної діїчинників наклітиниссавців in vitro (>визначеннякількостіживих ймертвихклітин укультурі,виявленняапоптозуелектрофоретичниманалізомнуклеосомноїфрагментації ДНК таелектрофорезоміндивідуальнихклітин угеліагарози (методДНК-комет)).Крім того,застосованоімунологічніметоди (>імуноензимний йцитохімічнийаналізантигенноїспецифічностіантитіл молокалюдини), атакожметодистатистичноїобробкирезультатівдослідження.

>Наукова новизнаодержанихрезультатів. Наосновірозробленоїсхеми очищенняантитіл ззаданоюантигенноюспецифічністю зсироваткикровіхворих нааутоімуннізахворювання (>системнийчервонийвовчак (>СЧВ),розсіяний склероз) та молокаклінічноздоровихжінокуперше очищенокаталітичноактивніантитіла (>абзими) класу IgG таIgAзіспорідненістю до АТР (>анти-АТР АТ),дволанцюгової ДНК (>анти-ДНК АТ) йгістонуН1 (>антигістонові АТ).Встановлено, щоанти-АТР АТсироваткикровіхворих насистемнийчервонийвовчак й молокаклінічноздоровихжінокволодіютьфосфотрансферазною (>протеїнкіназною йліпідкіназною)активністю,анти-ДНК АТ молокалюдиниволодіютьРНК-азною,ДНК-азною тапротеїнкіназноюактивністю, тоді якантигістоновим АТсироваткикровіхворих нарозсіяний склероз й молозивапородільвластивапротеазнаактивністьщододеякихлужнихбілків.

>Впершевиявленочинники, котрівпливають накаталітичнуактивністьабзимів. Показано, щодезоксирибоолігонуклеотидистимулюютьпротеїнкіназнуактивністьsIgA-абзимів молокалюдини, тоді якнуклеотидтрифосфатиінгібуютьїхнюнуклеазнуактивність.

>Виявлено, щоімуноглобулінисироваткикрові та молокаклінічноздорових людейіндукують зазагибельклітинлейкемії шляхомапоптозу. разом з тім, усироватцікрові окремиххворих нарозсіяний склерозприсутніімуноглобуліни,здатнііндукуватипроліфераціюлейкемічнихклітинлюдини.

>Теоретичнезначенняодержанихрезультатів.Впершеобґрунтованомеханізмпромітогенної діїIgG-абзимів наклітиниссавців, атакожмеханізмкаталізуантитіламифосфотрансферазноїреакції.Запропоновано модельвнутрішньоклітинноїнейтралізаціївірусів уепітеліальнихклітинах заучастюsIgA-абзимів.

>Практичнезначенняотриманихрезультатів. Уроботі проведеноаналізантигенноїспецифічності,каталітичної тацитотоксичноїактивностіімуноглобулінів,отриманих з молозиваклінічноздоровихпороділь. Наосновіотриманихрезультатівзробленовисновок про ті, щофункціональнівластивостіімуноглобулінів молозивазалежать відіндивідуальнихособливостей стану гуморальногоімунітету упороділь.Цівластивостіважливоврахувати под годину комплексноговизначенняпоказниківранніхаутоімуннихпорушень ужінок,пов’язаних зїхньоювагітністю тапологами.

>Особистийвнесокздобувача.Авторовіналежитьформулювання тими і метидосліджень,вибіроб’єктів, атакожвибір йрозробкаметодівдослідження, постановкаекспериментів.Експериментальнівизначення,обробкаданих,їхнійтеоретичнийаналізвиконані авторомсамостійно, чи за йогобезпосередньоюучастю. Автором проведеноаналізданихлітератури затемою роботи,сформульовано таобґрунтовановисновки таузагальнення.

>Науковим консультантомздійснювалосязагальнекерівництвопроведеннямдосліджень таобговоренняотриманихрезультатів уперіод роботидисертанта вІнститутібіологіїклітини НАН України.

>Апробаціяодержанихрезультатів.Основнірезультатидисертаціїобговорювались на ІІміжнароднійконференції “>CatalyticAntibodies andAntibodyEngineering” (>Шантілі,Франція, 1996); Xміжнародномуімунологічномуконгресі (>Нью-Делі,Індія, 1998);Кістоунськомусимпозіумі ізмолекулярної йклітинноїбіології (>Брекенрідж, США, 1999); IIIПарнасівськійконференції “>Mechanisms ofcellularsignaltransduction andcommunication” (Львів, 2000);Міжнароднійконференції “>RNAasTerapeutic andGenomicTarget” (>Новосибірськ,Росія, 2001);конференції НАТО “>Frontiers inautoimmunity:fundamentalaspects andclinicalperspectives” (>Кеслей,Угорщина, 2002);Установчомуз’їздіукраїнського товаристваклітинноїбіології (Львів, 2004); VПарнасівськійконференції (>Київ, 2005); XIУкраїнськомубіохімічномуз’їзді (>Харків, 2006); ІІІМіжнароднійконференції “Фундаментальні науки – медицині” (>Новосибірськ,Росія, 2007); ІІз’їздіукраїнського товаристваклітинноїбіології (>Київ, 2007).

>Публікації. Затемоюдисертаціїопубліковано 38науковихробіт, з них 25 статей уфаховихвітчизняних йміжнародних журналах, 1огляд татези 12доповідей нанауковихконференціях.

>Зміст таобсяг роботи.Дисертаціявключаєвступ,оглядлітератури,матеріали йметоди,результативласнихдосліджень, щоскладаються з 9розділів,аналіз таузагальненнярезультатівдосліджень,висновки, списоквикористаноїлітератури,якийнараховує 300найменувань. Текстдисертаціївикладено на 290сторінках машинописного тексту йпроілюстровано 118 малюнками й 5таблицями.

>ОСНОВНИЙЗМІСТРОБОТИ

>Матеріали йметодидослідженя.Отриманняелектрофоретичногомогеннихпрепаратівантитілєоднією знайбільшважливих умівдослідженняїхньоїфункціональноїактивності. Упершучергу,цестосуєтьсякаталітичноактивнихантитіл, котріволодіютьаналогічною зензимамикаталітичноюактивністю.Виділення та очищенняабзимівєдоситьскладнимзавданням. Цезумовленосукупністюфакторів.Відомо, щосумарніпрепаратиімуноглобулінівєполіклональними,складаються зрізноманітних заізотипомантитіл, котрімаютьспорідненість довеликоїкількостірізноманітнихантигенів,серед якіє іензими. Останніможутьзнаходитися укомплексі зантитілами, щоможе бути причиноюартефактів придослідженніїхньоїкаталітичноїактивності. Тому напершихстадіях очищенняауто-АТнеобхідновідділитиантитіла відрізноманітнихантигенів, упершучергу відбілків.Наступнимкроком винне бутивиділенняфракціїантитіл, Якаволодієспорідненістю доантигену –потенційного субстратукаталітичноїреакції.

На мал.1 наведеноузагальнену схему очищенняауто-АТ зсироваткикрові та молокалюдини, котрадозволяєотриматипрепаратиантитіл ззаданоюантигенноюспецифічністю,збагаченікаталітичноактивнимиантитілами.

Напершійстадії очищенняімуноглобуліниосаджували 50% сульфатомамонію. Цедозволяєвідділитифракціюімуноглобулінів відосновноїмасибілківсироваткикрові чи молока.Наступнастадіявключаєафіннухроматографію наколонці, котраміститьпротеїн A - чипротеїн G -агарозу (чисефарозу). Длявидаленнядомішок колонкипромивалирозчинами зпідвищеноюконцентрацієюNaCl (0,3–0,5 М) уприсутностінеіоннихдетергентів (>NP-40, тритонХ-100).Елюціюімуноглобулінів з колонки проводили буфером знизькимзначенням рН (1 Mоцтова кислота чи 0,1 Мгліцин-HCl, рН 2,6).Використанняцихсорбентівдозволяє вже впершихстадіях очищенняотриматипрепарати, котрі на 90-95%складаються зімуноглобулінів. Дляподальшої очищенняантитіл чиїхньогорозділення насубкласи (>наприклад,sIgA та IgG молозива)використовувалиіонообміннухроматографію чинапівпрепаративнугель-фільтрацію (>Невинский таін., 2000).Препаратиантитіл,очищені в такий спосіб,єелектрофоретичногомогенними (>рис.1А, Б) йпридатні длявиділенняантитілзіспорідненістю допевнихантигенів чисубстратівкаталітичноїреакції.

>Отриманіпрепаратиімуноглобулінів уподальшомуслугували длявиділеннямоноспецифічнихполіклональнихантитіл зсироваткикрові й молокалюдиниафінноюхроматографією на колонках, котрімістятьсорбенти зковалентнозв’язанимилігандами.Сорбентамислугували:АТР-сефароза,ДНК-целюлоза,гістонН1-сефароза.Залежно відспорідненості досорбентів,антитілаелюювалиградієнтомконцентрації 0–1 МNaCl (>анти-АТР IgGсироваткикровіхворих насистемнийчервонийвовчак), 3,5 MMgCl2 (>анти-АТРsIgA молозивапороділь), 50мМNaOH (>анти-ДНКsIgA молозивапороділь), 0,1 Мгліцин-HCl, рН 2,6 (>антигістонові АТсубкласів IgG таsIgAсироваткикровіхворих нарозсіяний склероз й молозивапороділь).

>Визначенняпротеїнкіназноїактивності. Дляаналізупротеїнкіназноїактивності АТ йrsCD4 донором фосфату був [>g-32P]ATP (5000Ki/ммоль, “>Изотоп”,РосійськаФедерація).Реакційнесередовищемістило 0,3 – 3 мкгбілка,20мМтрис-HCl, рН 7,4, 5-10мМMgCl2, 25мкКі [>g-32P]ATP. Удеякихвипадках, уреакційнесередовищедодатковододавали АТР,казеїнкоров’ячого чилюдського молока.Реакціюфосфорилювання проводиливпродовж 30хв при 37 °З йзупинялидодаваннямденатуруючогорозчину (65мМтрис-HCl, рН 6,8, 1%Ds-Na, 2%2-меркаптоетанол, 10%гліцерин) чи 10%ТХО.Білкирозділялиелектрофорезом у 12%ПААГ, чи уградієнті 6-16,5%ПААГ уприсутності 0,1%DS-Na.ГеліфарбувалиCoomassieR-250,висушували йпіддавалиавторадіографіїпротягом 20 рік.

>Визначенняліпідкіназноїактивності. Дляаналізувикористовувалипрепарати IgG йsIgAрізногоступеня очищення.Реакціюфосфорилювання проводили усередовищі, якумістило 20мMтрис-HCl, pH 7,5, 3мМMgCl2 й 20мкКі [>g-32P]ATP.32Р-міченіліпідиекстрагувалирозчином хлороформ: метанол (2: 1) йрозділяли напластиніKieselgel 60 усистемі хлороформ: метанол:7МNH40H (60: 35: 5).Пластинувисушивали йпіддавалиавторадіографії.

>Визначеннянуклеазноїактивності.Нуклеазнуактивністьімуноглобулініввизначали згідноранішеописаної методики (>Shuster et al., 1992). як субстратвикористовувалинадспіралізовану талінійнуформиплазмідної ДНК,тотальну РНК E.coli чирибосомну РНКклітинаденокарциномилюдинилініїA549. Дляаналізузразки, котрімістили 1-5 мкгбілка,інкубували з 3-5 мкгнуклеїнових кислот у 20мМтрис-HCl, 75мМNaCl, 10мМMgCl2протягом 1 рік при 37 °З.Ефекторамиреакціїслугували 0,1-3мМ АТР чи 1мМGTP,СТР,TTP,dATP,dGTP,dCTP,dTTP.Продуктиреакціїрозділялиелектрофорезом у 1%агарозі утрис-борат-ЕДТАбуфері, рН 8,3 уприсутності 0,001% бромистогоетидію. Гельфотографували приультрафіолетовомуосвітленні.

>Визначенняпротеазноїактивності. Дляаналізупротеазноїактивності АТ субстратамислугувалигістони тимусутеляти йцитохром З („>Fermentas”,ЛитовськаРеспубліка).Реакціюгідролізу проводили убуфері,якиймістив 20мМтрис-HCl, pH 7,5 уприсутності 3мг/млбілка й 0,05 – 0,3мг/мл АТупродовж 1-3 рік при 37 °З.Реакціюзупинялидодаванням уреакційнесередовище4-кратногоденатуруючого буферу (0,2 Мтрис-HCl, рН 6,8, 4%Ds-Na, 8%2-меркаптоетанол, 40%гліцерин) йбілкирозділялиелектрофорезом у 12%ПААГ уприсутності 0,1%Ds-Na.ГеліфарбувалиCoomassieG-250.

>Аналізкаталітичноїактивності АТ послерозділеннягель-фільтрацією за умівдисоціаціїімуннихкомплексів (>рН-шок).Препарати АТпіддавалигель-фільтрації наколонцірозміром 180 x 5 мм, котрамістилаToyopearlTSKHW-55 („>ToyoSoda”,Японія).Білкипрепаратів АТпопередньоосаджували 50% сульфатомамонію і облогрозчиняли в 0,1 Мгліцин-HCl, рН 2,6 чи 50мМNaOH.Елюціюбілків проводилицими жрозчинами.Хроматографічніфракції (300мкл)збирали,нейтралізували йдіалізувалипроти буферу, щомістив 20мМтрис-HCl, pH 7,5, 0,1 МNaClпротягом 18 рік.Вмістбілківаналізувалиелектрофорезом уградієнтіПААГ (7 – 18,5%) уприсутності 0,1%Ds-Na. Дляаналізукаталітичноїактивності відхроматографічнихфракційвідбиралиаліквоти (30мкл),додавали 6 мкг субстрату (>плазмідна ДНК,гістонН1) іінкубували 2 рік при 37 °З.Продуктиреакціїрозділялиелектрофорезомзалежно відприроди субстрату.

>Афіннамодифікаціябілківреакційноздатними аналогами АТР йолігонуклеотидів. Длявиявлення АТР - йДНК-зв’язувальнихділянок на молекулахбілківвикористовувалиреакційноздатніпохідніАТР(ClR-Р-ppA) й [>g-32P]ATP(ClR-32Р-ppA), атакож32Р-мічений14-мірнийдезоксириботимідилат (>ClRCH2NHp(T) 14), котрі булисинтезовані до. б. зв.ЯкубовимЛ.А. (>Інститутхімічноїбіології йфундаментальноїмедицини,Новосибірськ,РосійськаФедерація).Реакційноюгрупоюслугувалаалкілуючасполука 4- [(>N-2-хлоретил-N-метил)аміно]бензиламін,приєднана до5'-кінцевоїфосфатноїгрупиолігонуклеотиду чиg-фосфату [>g-32P]ATP (мал.2).

>Афіннумодифікаціюбілків (>sIgA,rsCD4) проводили узабуференомуфізіологічномурозчині (>ЗФР: 0,14 МNaCl, 10мМNaН2РО4, рН 7,5) уприсутності 10мкМалкілуючого реагентупротягом 45хв при 37 °З.Конкурентами уреакціїслугували: ДНК тимусутеляти,сумарна РНК E.coli й гепарин уконцентрації 1мг/мл чи 30мкМd(T) 14.Післязавершенняінкубації дореакційногосередовищадодавалиденатуруючий буфер (2%Ds-Na, 50мМтрис-НCl, рН 6,8, 4%2-меркаптоетанол, 20%гліцерин) йбілкирозділялиелектрофорезом у 10%ПААГ уприсутності 0,1%Ds-Na.Гелівисушували й проводилиїхнюавторадіографію.

>Імуноензимнийаналіз (>ІЕА).ІЕА проводили згідноописаноїнижче методики. Длясорбціїантигенів у лунки96-лункового планшету дляімунологічниханалізів вносили 30мклрозчину,якиймістив 2 мкггістонів чидволанцюгову ДНК у 0,1 МK2CO3/KHCO3, pH 8,6, іінкубувалипротягом 18 рік при 4 °З.Лункипромивали (3 рази) 200мкл буферу А (1% БСА уЗФР),додавали 15 мкгантитіл у 200мкл буферу А іінкубувалипротягом 2 рік при 37 °З.Лункитричіпромивали 200мкл буферу А,додавали 50мклрозчинукон’югатубілок А – пероксидазахрону ("Sigma", США) урозведенні 1: 500 іінкубувалипротягом 1 рік при 37 °З.Лунки планшетутричіпромивали 200мклЗФР уприсутності 0,05%Twin-20 йфарбувалирозчиномдіамінобензидин/Н2О2протягом 30хв при 37 °З.Реакціюзупиняли 1 Мортофосфорноюкислотою.Оптичнугустинурозчинувизначали придовжиніхвилі 492 нм наспектрофотометріNanoDropND 1000 („>NanoDropTechnologies”, США).Рівеньауто-АТ у лункахвираховували завеличиноюоптичногопоглинаннярозчинузабарвленихпродуктівпероксидазноїреакції.Визначення проводили утрьохпаралельнихдослідах.

>Клітини таїхнєкультивування. Уроботівикористовуваликлітиннілінії,одержані ізколекціїІнститутуекспериментальноїпатології,онкології тарадіобіології НАН України:Jurkat –лейкемічніТ-лімфоцитипериферичноїкровілюдини,Namalwa –В-лімфоцитилюдини (>лімфомаБеркіта);L1210 –лейкемічніВ-лімфоцитимиші,L929 –трансформованіфібробластимиші.Клітиникультивували усередовищіRPMI-1640 чиDMEM („Sigma”, США) уприсутності 10%сироваткикровіембріонів ВРХ („Sigma”, США) й 50мкг/млгентаміцину.

>Аналізцитотоксичноїактивностіпрепаратівантитіл.Клітиниінкубували з препаратами АТ (>кінцеваконцентрація 0,7мг/мл)протягом 24, 48 чи 72 рік.Фарбуванняклітин проводили 0,1%воднимрозчиномтрипановогосинього.Кількістьнезабарвленихживих йзабарвленихмертвихклітинпідраховували угемоцитометричнійкамері подсвітловиммікроскопомБиолам Р (>ЛОМО,РосійськаФедерація).Індексжиттєздатності (>IЖ)визначали заформулою:IЖ =O/C x 100, де Про –кількістьживихклітин укультурі подвпливом АТ, З –кількістьживихклітин укультурі увідсутності АТ.

>Аналізсубклітинноїлокалізаціїантигенівауто-АТ.КлітинивідмивалиЗФР відкультуральногосередовища,готувалицитологічні мазки,фіксували їхнього метаноломпротягом 90 сек йвисушували прикімнатнійтемпературі.Після цого мазкиінкубували із препаратамиIg (>розведення 1: 75) при 4 °Зпротягом ночі.Післяінкубації мазкипромивалиЗФРдвічі по 10хв таінкубували зFITC-міченими IgGкози,специфічними доН-ланцюгівIgAлюдини, чикон’югованими зпероксидазоюхрону IgG кролика,специфічними доН-ланцюгів IgGлюдини („Sigma”, США), урозведенні 1: 50протягом 1,5 рік при 37 °З. МазкипромивалиЗФР,фарбувалифлуоресцентнимбарвникомDAPI (1мкг/мл)протягом 1хв,зновупромивалиЗФР,дистильованою водою йфотографували подмікроскопомМикмедК-2-12 („>ЛОМО”,Росія) привідповіднихдовжинаххвилізбудження таемісії длявиявленняфлуоресценції. Увипадку, коли длядетекціївикористовуваликон’югати АТ зпероксидазоюхрону,комплексиантиген-АТфарбувалирозчиномдіамінобензидин/Н2О2 уприсутності 100мМNiCl2протягом 30хв при 37 °З йвиявлялимікроскопією увидимійобласті спектру.

>Виділенняфрагментованої ДНК таїїелектрофорез угеліагарози.Клітини послекультивування з препаратами АТосаджувалицентрифугуванням при 2000об/хвпротягом 5хв. До облогуклітиндодавали 0,5 мл холодногоЗФР тафіксували,поступовододаючи досуспензіїклітин 5 мл холодногорозчину 70%етанолу.Клітинизалишали на 12 рік при - 20 °З (>деякізразкизберігали приданійтемпературіпротягом 3-4тижнів).Після цогоклітиницентрифугували при 2000об/хвпротягом 5хв.Осадклітин (2-3 млн.клітин)ресуспендовували у 40мклфосфат-цитратного буферу,якиймістив 192частини 0,2 МNa2HPO4 та 8частин 0,1 Млимонноїкислоти, рН 7,8, тазалишали прикімнатнійтемпературі на 30хв.Післяцентрифугування при 3000об/хвпротягом 5хвнадосадовурідину переносили усвіжупробірку типуЕппендорф тадодавали 3мкл 0,25% водногорозчинуNP-40 („Sigma”, США) та 2мклРНК-ази А (>розчин 10мг/мл уводі).Після1-годинноїінкубації при 37 °З досуспензіїдодавали 5мклпротеїнази До („Merck”,Німеччина) (>розчин 1мг/мл уводі) таінкубували 1 рік при 37 °З.Післяінкубації до препарату ДНКдодавали 12мкл буферу,якиймістив 0,25%бромфеноловогосинього, 50мМтрис-HCl, рН 7,5, 50%гліцерину йрозділяли один%геліагарози уприсутності 0,005%етидіюброміду принапрузі 4В/смпротягом 2 рік.Фрагменти ДНКвиявляли приультрафіолетовомуосвітленні йфотографувалицифровоюкамерою NikonCoolpix 4200.

>Мікроелектрофорез ДНК окремихклітин угеліагарози (методДНК-комет).Аналізздійснювали, як описано (>Камінський таін., 2005). Дляформуваннягелю,предметніскельцяпокривалиплівкоюагарози шляхомнанесення 2 мл 1%тугоплавкоїагарози („>Serva”,Німеччина) йвисушування утермостаті при 37 °>С.40мклсуспензіїклітин вносили упробірку типуЕппендорф йпоміщали уводяну лазню при 40 °З,змішували з 120мклрозчинулегкоплавкоїагарози („>Serva”,Німеччина) (>кінцеваконцентраціяагарозистановила 0,75%),швидко завдавали натепліпредметніскельця 150мклтакоїсуміші йпокривалитеплимпокривнимскельцем.Післязастиганняагарозиобережнознімалипокривнескельце й вносили улізувальний буфер (2%лаурилсаркозинат, 0,5 МЕДТА, рН 7,5, 0,3мг/млпротеїнази До).Геліінкубували при4о Зупродовж 1 рік, апотім 20 рік при 37 °З.Гелівитримувалитричі по 20хв убуферіТБЕ (90мМтрис, 90мМборноїкислоти та 2мМЕДТА, рН 8,5), после чого вносили велектрофоретичну камеру й заливалицим ж буфером (2-3 мм буферу надскельцем).Електрофорезздійснювали принапрузі 0,6В/смпротягом 25хв,причомуелектричне поліскеровували впоперек предметногоскельця.Післялужногоелектрофорезупрепаратинейтралізували у 0,4 Мтрис-HCl, рН 7,5.Гелівисушували йфарбуваливоднимрозчинометидіюброміду уконцентрації 2мкг/мл.

>Комп’ютернийаналізрівнягомологіїпослідовностейамінокислотімуноглобулінів й рецептораСD4 тапротеїнкіназ.Амінокислотнупослідовність рецептораСD4 таFc-фрагментівімуноглобулінів було ботримано збазиданихSwiss-Prot. Дляаналізурівнягомологіївикористовували банкгенівпротеїнкіназKinBase тапрограмипорівнянняKinomBlastServer (kinase.com).Аналіздоменноїорганізації рецептораСD4 проводили,використовуючи базуданихSMART (>smart.embl-heidelberg. de) таPfam (>pfam.wustl.edu).ПошукфункціональнихмотивівмолекулиСD4здійснювали,застосовуючи базуданихScansite тапрограмупорівнянняMotifScan (>scansite.mit.edu).

>Статистичнаобробкаотриманихрезультатівдосліджень.Усідослідиповторювали 3-5разів. Уроботі наведеносереднізначення величин йстандартніпохибки (>M±m).Статистичнийаналіз проводили,користуючиськритеріємСт’юдента (>t).Вірогіднимивважалидані увипадку, колир0,05.Побудовуграфіків тастатистичнуобробкуданихздійснювали задопомогоюкомп’ютернихпрограмOrigin 4.0 та Excel 97.

>РЕЗУЛЬТАТИДОСЛІДЖЕНЬ ТАЇХОБГОВОРЕННЯ

>Впливпрепаратівантитілсироваткикрові та молокалюдини наріст йвиживанняТ-клітинлініїJurkat.Аналізвпливупрепаратівсумарнихімуноглобулінів (>Ig),отриманих зсироваткикрові 22хворих нарозсіяний склероз (РС), й 25зразків молозиваклінічноздоровихпороділь,отриманихосадженням 50%cульфатомамонію, показавши, щозалежно віддонорів,ціпрепаратиможуть якпригнічувати, то йстимулюватирістТ-клітинлініїJurkat in vitro (рис.3). Навідміну відIgхворих нарозсіяний склероз,препаратиIg,отримані зсироваткикровіздоровихдонорів, убільшостівипадківпригнічувалирістклітин in vitro.Рівеньгальмування приростуТ-клітинлініїJurkat поддієюIgздоровихдонорів бувблизьким дорівнягальмування приростуцихклітин подвпливомIgхворих нарозсіяний склероз. При цьомужоден з 25препаратівIgздоровихдонорів неволодівпромітогенноюактивністющодоТ-клітинлініїJurkat.Співвідношеннякількостіживих ймертвихклітин у цьомудослідівказує тих, щодеякіпрепаратиIg молозивапородільволодіютьцитотоксичноюактивністющодо Т -клітинлініїJurkat.

>Гель-електрофорезоміндивідуальнихклітин (>аналізДНК-комет), атакожелектрофоретичниманалізомміжнуклеосомноїфрагментаціїядерної ДНКвстановлено, що зазагибельТ-клітинлініїJurkat подвпливомцитотоксичнихпрепаратівIg молозивапородільвідбувається шляхомапоптозу (рис.4).

>Наступнедослідження показало, щоподібно доIg молозивапороділь,окреміпрепаратиIg,очищені зсироваткикровіхворих нарозсіяний склероз йздоровихдонорів,такожіндукують апоптозцихТ-клітин.

>Отриманірезультативказують наособливостівпливупрепаратівімуноглобулінів наріст йвиживанняТ-клітинлініїJurkat, щоможевідображатиіндивідуальний стан гуморальногоімунітетудонорів.Відмінності у діїпрепаратівIgщодоклітинможуть бутипов’язані зприсутністю вїхньомускладіауто-АТпевноїантигенноїспецифічності йкаталітичноїактивності.Особливоїувагизаслуговує тієї факт, щодослідженіпрепаратисумарних АТсироваткикровіхворих нарозсіяний склероз й АТ молозивапрородільволоділи якцитотоксичною, то йпромітогенноюактивністющодоТ-клітинлініїJurkat.Ціданівказують тих, що умолозивілюдиниможуть бутиприсутніауто-АТ, котрі засвоєюантигенноюспецифічністю йбіологічноюактивністюподібні доауто-АТсироваткикровіхворих нааутоімуннізахворювання.

>Ауто-АТ молозиваклінічноздоровихпороділь.Характерноюознакоюаутоімуннихпорушень ворганізмілюдиниєпоявависокоспецифічнихауто-АТ доядернихантигенів –дволанцюгової ДНК тагістонів. ЗадопомогоюІЕА було бпроаналізовано 25препаратівIg

Страница 1 из 3 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація