Реферати українською » Наука и техника » Незримое вбрання голих тварин


Реферат Незримое вбрання голих тварин

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Юлій Олександрович Лабас, кандидат біології, провідний науковий співробітник інституту біохімії им.А.Н.Баха РАН.

Ганна Вікторівна Гордєєва, молодший науковий співробітник тієї самої інституту.

Олена Григорівна Наглер, старший науковий співробітник інституту біохімічної фізики им.Н.М.Эммануэля РАН.

І ми пам'ятаємо казку Г.- Х.Андерсена “Новий наряд короля”. Король, будучи голим, думав, що аж вбачає свого сукні, а коли це усі його піддані, не знайшов собі сил визнати їх правоту. Однак у природі й справді є істоти, одягнені в невидиму нам одяг, її помічають ті, для чийого “погляду” призначений. Незримое вбрання подібних істот “виткано” з про активних форм кисню (АФК). У статті ми розповімо, що за тварі, навіщо їм потрібні невидима одяг, як його “шиють” і до кого дано “бачити” її. Але спочатку розглянемо докладніше, що є ці активні форми кисню*.

* Про це див. також: Скулачев В.П. Кисень на живу клітині: добро і зло // Природа. 1997. №11. С.26-35.

Усі активні форми кисню - це продукти неповного відновлення молекули O2. Серед АФК є договір радикали, наприклад супероксид ·O2-, гидроксильный радикал ·ВІН, і молекули - перекис водню Н2O2, хлорнуватиста кислота НClO (її аніон СlO- називається гипохлоритом).

Є кілька шляхів освіти АФК в організмі. Вони як побічного продукту процесах аэробного метаболізму, тоді як дихальної ланцюга мітохондрій (енергетичних станцій клітини) кисень відновлюється в повному обсязі. Утворюються АФК і завдяки роботи деяких цитозольных ферментів, наприклад ксантиноксидазы, і також як побічний продукт [1]. Проте і ферменти, єдине призначення яких - генерація активних форм кисню.

Серед таких ферментів особливого уваги заслуговує NADPH (никотинамидадениндинуклеотидфосфат)-оксидаза плазматичної мембрани (NADPH-oxidase - NOX). Вона відновлює молекулярний кисень у позаклітковому просторі до супероксида ·O2-, окисляя у своїй цитозольный NADPH до NADP+. У тварин знайдено п'ять изоформ (изозимов) цього ферменту, виконують різні функції у різних тканинах і органах [2].

З-поміж інших ферментів, генеруючих АФК, назвемо решта 2. Це миелопероксидаза (myeloperoxidase - MPO) і його природний гібрид з NADPH-оксидазой. Перший фермент відпо-відає освіту хлорнуватистої кислоти HСlO з перекису водню і хлорид-аниона [3], а гібрид, тобто. подвійна оксидаза (dual oxidase - DUOX), відразу перетворює супероксид ·O2- в перекис водню, які потім окисляє різні внеклеточные субстрати [4].

NADPH-оксидаза і миелопероксидаза уперше виявлено у білих кров'яних тельцах - макрофагах і нейтрофилах. Під час зустрічі з патогенними мікроорганізмами ці клітини або “обстрілюють” їх супероксидом ·O2-, або піддають “хімічної атаці” перекисом водню Н2O2 і хлорнуватистої кислотою НClО, або поглинають мікроорганізми, заганяючи в “газові камери” - спеціальні пузырьки-фагосомы, що й обробляють перекисом і супероксидом [5].

Останні 10 років ферменти, подібні NADPH-оксидазе білих кров'яних тілець, знайдено переважно тканин та органів вищих тварин, зокрема людини, і рослин [2]. У шлунково-кишковому тракті изозим NOX1 виконує захисну функцію; NOX2 регулює процеси старіння в головному мозку; NOX3 - освіту слухових камешков-отолитов у внутрішньому вусі, NOX4 - формування червоних кров'яних тілець (еритроцитів) в нирках у вигляді регуляції вироблення спеціальних речовин, эритропоэтинов, а посудинах контролює кров'яний тиск, керуючи їх тонусом. NOX5 забезпечує запліднюючу здатність чоловічих статевих клітин (сперматозоїдів), контролює пролиферацию лімфоцитів. У легких також є изозим NADPH-оксидазы, він регулює вентиляцію.

Изозимы NOX різняться за своєю структурою, тому механізми їх активації також різні. Так, NOX білих кров'яних тілець активується лише за участі протеинкиназ - ферментів, “пришивающих” до NOX залишки ортофосфорной кислоти. NOX1 слизової шлунка влаштований отож у його роботи потрібно фосфорилирование - він працює самостійно й більше постійно. Щодо запуску роботи NOX5 в сперматозоидах протеїнкінази непотрібні, зате необхідні вільні іони кальцію Ca2+.

У рослин изозимы NADPH-оксидазы служать захисту від інфекцій, беруть участь у біосинтезі фитогормонов, формуванні клітинних стінок плодів, регулюють іонні потоки, забезпечують гравитропизм коренів. Також, як у разі з NOX5, для активації рослинних изозимов в фосфорилировании не потрібно, але потрібні катиони Са2+.

Подвійна оксидаза DUOX, природний гібрид NOX і МРО, забезпечує біосинтез тироксину - гормону щитовидної залози. Барьерные властивості слизових оболонок ротовій порожнині, пряма кишка, геніталій, і навіть трахеї і бронхів значною мірою зумовлені цією оксидазой. У круглих хробаків (зокрема, могильного хробака Caenorhabditis elegans, котрогось із улюблених об'єктів генетики) подвійна оксидаза забезпечує правильне формування кутікули. У морського їжака активація DUOX супроводжує кортикальную реакцію (відшарування желточной оболонки) в яйцеклітині, предотвращающую проникнення зайвих сперматозоїдів.

Отже, генерація АФК “експорту” поширена. Самі активні форми кисню виконують у своїй дуже різні функції: від захисної (макрофаги, нейтрофіли, епітелій слизових оболонок) до будівельної (кутикула круглих хробаків, клітинні стінки рослин).

Інтенсивна продукція активних форм кисню здатне викликати загибель клітини [5]. Для захисту від окисного стресу, викликаний АФК, існують два ферменту - супероксиддисмутаза і каталаза. Перший перетворює супероксид ·O2- в перекис водню, а другий розщеплює Н2O2 до води. Крім зазначених ферментів, кожна клітина оснащена запасом низькомолекулярних антиоксидантів, які перехоплюють токсичні радикали, не дозволяючи їм пошкоджувати структурні клітинні елементи. Серед антиоксидантів може бути трипептид глутатион, a-токоферол (вітамін Є), ретинол (вітамін А). У клітинах часто пов'язані з спеціальними білками, связывающими антиоксиданти. Перелічені захисні ферменти і низькомолекулярні речовини разом формують антиоксидантну систему [1].

У 1995р. одне із авторів цієї статті, Ю.А.Лабас, вивчаючи биолюминесцию (яскраве импульсное чи статична світіння, добре помітна у темряві) водних організмів, припустив, що це биолюминесцентные системи походять від антиоксидантных систем *, захищають клітину від генерируемых нею ж самої АФК [6]. Щоб перевірити це припущення, вимагалося з'ясувати, генерують чи АФК світні клітини (фотоциты) биолюминесцентного тваринного. Об'єктом досліджень ми вибрали біломорського гребневика Bolinopsis infundibulum, далекого родича медуз і коралів. Для виявлення продукції АФК фотогенной тканиною використовували водорозчинний барвник нитросиний тетразолий (НСТ), який за взаємодії з супероксидом перетворюється на нерастворимую форму (диформазан).

* Лабас Ю.О., Гордєєва А.В. Неразгаданная Дарвіном біолюмінесценція // Природа. 2003. №2. С.25-31.

Яке було наше подив, коли ми побачили, що диформазановый осад пофарбував як фотогенную тканину, а й усю поверхню тіла тваринного! Тоді ми почали занурювати в розчин барвника будь-кого - губок, актиній, морських і прісноводних гидроидных поліпів, молюсків, офиур (близьких родичів морських зірок) і навіть личинок риб і амфібій. Морских тварин нам люб'язно надавали акваріумні фірми “Атол”, “Аква-Лого” і “Коралл-Аквариум”, а прісноводних - кафедра ембріології біологічного факультету МДУ.

З'ясувалося, що фактично все тварини без зовнішнього скелета чи кутікули генерують активні форми кисню зовнішніми поверхнями. Проте характер диформазановой забарвлення в різних тварин був є неоднаковим. Уся поверхню тіла фарбувалася тільки в губок і гребневиков (щоправда, в тих найбільше скупчення диформазана спостерігалося на меридіональних лавах гребних платівок). У кишечнополостных (актиній, медуз, прісноводної гідри) офарблювалися лише щупальця і ротовій апарат. У тварин, мають раковину чи щитки (у молюсків, офиур), диформазан офарблював відкриті ділянки тіла - підошву і науковотехнологічна галузь рота молюска, межщитковую поверхню офиуры. Морські гидроидные поліпи здавалося б представляли виняток: вони диформазановый осад випав саме у зовнішньому покрові - перисарке. Та оскільки перисарк не затримує іони, на цей випадок не вважається з низки он які виходять. Беспозвоночные з кутикулой чи зовнішнім скелетом - многощетинковые і плоскі хробаки, рачки-бокоплавы, личинки комара коретры - не офарблювалися диформазаном. Також була пов'язана з ікрою і личинками риб [7].

Дані, отримані з допомогою фарбування нитросиним тетразолием, вимагали підтвердження іншими методи дослідження. Такими методами стали електронний парамагнетичний резонанс (Епр) і хемилюминесценция. Генерація супероксида зовнішньої поверхнею губок було підтверджено і тих, та інших методом [7, 8], а актиній - лише хемилюминесценцией (з невідомих причин Епр не виявив генерацію ними ·O2-). Ікра й личинки костистої риби в'юна Misgurnus fossilis і африканської шпорцевой жаби

Вплив стимулятора протеїнкінази З форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 10 нМ) на хемилюминесценцию актинії Aiptasia pulchella.

Тут і далі стрілкою позначений додавання агента.

До - результат контрольного експерименту, тобто. хемилюминесценция самого тваринного не додаючи ФМА.

Посилення хемилюминесценции губки Sycon sp. під впливом иономицина (0.3 мкМ).

Морські і прісноводні безхребетні, зовнішні поверхні яких офарблюються диформазаном - відновлених продуктом взаємодії АФК з нитросиним тетразолием (НСТ). Кожну тварину показано двічі: яким було буває природі (зліва) і після годинникового перебування у розчині (0.01%) барвника НСТ. Очевидно, що все поверхню тіла забарвлюється тільки в морської губки Sycon sp., яка ні зовнішнього скелета, ні кутікули. В інших тварин забарвлення набувають різні структури: у гребневика Bolinopsis infundibulum - меридіональні ряди гребних платівок; у морських гидроидных поліпів Оbelia longissima, Gonothyrea loveni - перисарки; в інших кишечнополостных (у сцифомедузы Aurelia aurita, актиній Аiptasia pulchella і Мetridium senile) - щупальця і гипостом; у брюхоногого молюска Diodora sp. - мантийный край і науковотехнологічна галузь рота; у офиуры Amphipholis squamata - межщитковая поверхню.

Xenopus laevis, які давали реакції з нитросиним тетразолием, тим щонайменше, мали хемилюминесценцией [7]. Це наштовхнуло нас стало на думку, що вони генерують не супероксид, а перекис водню. Наше припущення побічно підтвердилося: група бразильських учених виявила, що зябрами дорослої прісноводної риби пецилии секретируется саме Н2O2 [9].

Дослідження механізмів виявленого нами явища вимагало додаткових зусиль. Вирішили випробувати, як діють продукції АФК зовнішніми поверхнями тварин агенти, що стимулюють чи придушують синтез цих форм білими кров'яними тільцями. Тепер досліди проводилися спеціально найбільш примітивних з вже досліджених нами тварин, тобто. на губках Sycon sp. і актиниях Aiptasia pulchella. Выявляли генерацію АФК все тим самим методом - хемилюминесценцией.

Щоб викликати продукцію АФК макрофагами чи нейтрофилами, часто застосовуються речовини, що стимулюють протеинкиназу З (фермент, активуючий NADPH-оксидазу з допомогою фосфорилювання), підвищують проникність клітинної мембрани для іонів Са2+ (ионофоров) чи викликають фагоцитоз. Ми використовували речовини всіх трьох напрямів дії. Як стимулятора протеїнкінази З застосували форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), а ионофором Са2+ був иономицин. Обидва ці речовини викликали вибух хемилюминесценции [7, 10]. Зимозан (фрагменти сухих клітинних стінок дріжджів), яких ми стимулювали фагоцитоз, посилював хемилюминесценцию лише губок, але з актиній [10]. Отже, тільки в губок продукція АФК зовнішньої поверхнею пов'язані з фагоцитозом.

Реакція актиній на иономицин і ФМА мала, найімовірніше, з NADPH-оксидазой у тому амебоцитах (клітинах між екто- і энтодермой), на про мезентериальных нитках, виконують таку ж роль, як і наші макрофаги і нейтрофіли. Зимозан, на відміну ФМА і иономицина, не проникав через зовнішні покрови актиній, тому надавав ними впливу.

Як інгібіторів NADPH-оксидазы і миелопероксидазы ми вибороли азид натрію NaN3 і ацетованиллон. Азид натрію придушує активність всіх ферментів, містять гем (комплексне з'єднання порфирина). До них належать і ферменти білих кров'яних тілець, що утворюють АФК. Ацетованиллон - це специфічний інгібітор NADPH-оксидазы. У експериментах азид натрію придушував хемилюминесценцию і губок, і актиній, а ацетованиллон гасив світіння губок (на актиниях досліди не проводилися) [7, 10].

Вплив зимозана (0.2 мг/мл), стимулятора фагоцитозу, на хемилюминесценцию губки Sycon sp.

Зміна хемилюминесценции актинії Aiptasia pulchella після додавання азида натрію (1 мМ) - інгібітору гемсодержащих ферментів.

Отримані результати дозволили припустити, що у крайнього заходу механізми генерації активних форм кисню зовнішньої поверхнею губок і білими кров'яними тельцями подібні. Як організовано виробництво АФК актиній, залишалося остаточно незрозумілим. Щоб все-таки з'ясувати це, вирішили ідентифікувати ферменти, що утворюють АФК, безпосередньо міряючи активність. Оскільки у актиній генерація супероксида зовнішньої поверхнею була підтверджено методом Епр, вирішили, що найшвидше це NADPH-оксидаза. “Підозра”, в такий спосіб, впала на миелопероксидазу і подвійну оксидазу.

Перший фермент виявляє дві активності: пероксидазную (здатність окисляти різні субстрати з допомогою Н2O2) і хлорирующую. У подрібнених тканинах (гомогенатах) актиній ми змогли знайти тільки першу. Отже, ми мали працювати з певної пероксидазой, де немає хлорирующей активності. Ми схиляємося до того що, що це то, можливо подвійна оксидаза [10].

Оскільки ксантиноксидаза - теж кальций-зависимый фермент [1] й теоретично міг би активироваться иономицином, вирішили з'ясувати її причетність до компаній АФК у актиній і губок. Ні в тих, ні в інших ми виявили ксантиноксидазную активність; по крайнього заходу, використовуваний нами метод не виявив будь-яких її слідів [10].

Тепер потрібно було у цьому, що генерація АФК морськими беспозвоночными є активний процес, а чи не пасивну відплив внаслідок слабкої активності каталази, як відбувається в прісноводної риби пецилии [9]. Тому ми вимірювали активності основних антиоксидантных ферментів - супероксиддисмутази (СОД) і каталази в гомогенатах актиній і губок. Подібно нейтрофилам і макрофагам, ці тварини мають антиоксидантными ферментами, які захищають їхнього капіталу від повреждающего дії АФК. Проте якщо з генеруванням АФК зовнішніми поверхнями актиній і губок такий захист не збалансована. У цих безхребетних тварин активності таких ферментів досить високі тоді як тими, які притаманні “професійно” генеруючих АФК клітин ссавця - макрофагів і нейтрофилов морської свинки. Отже, можна було виключити пасивну відплив АФК як єдиного способу їх видалення

Страница 1 из 2 | Следующая страница

Схожі реферати:

Навігація